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利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌
被引量:
5
1
作者
闫继爱
张雪
+3 位作者
张芸
左佃光
陈宁
温廷益
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第3期79-84,共6页
利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通...
利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065L-苏氨酸的产量为5.55±0.51g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065L-苏氨酸产量为9.77±1.83g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065L-苏氨酸产量为8.65±1.42g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。
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关键词
大肠杆菌
RED同源重组
基因敲除
L-苏氨酸
发酵
原文传递
含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响
被引量:
11
2
作者
张雪
闫继爱
+4 位作者
于雷
张国强
张芸
陈宁
温廷益
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第5期591-596,共6页
【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对L-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrLp、...
【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对L-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrLp、编码前导肽基因thrL以及thrA、thrB、thrC基因,通过重叠延伸PCR的方法对thrA基因定点突变,解除苏氨酸对它的反馈抑制,构建出重组表达质粒pWYE112和pWYE134,5L发酵实验测定L-苏氨酸的产量。【结果】经5L发酵罐发酵产酸实验,W3110的L-苏氨酸产量为0.036±0.004g/L,携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110菌株L-苏氨酸产量为2.590±0.115g/L,质粒上thrA解除反馈抑制后,L-苏氨酸的产量增加到9.223±1.279g/L。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使L-苏氨酸积累,进一步解除thrA基因的反馈抑制,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。
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关键词
L-苏氨酸
重叠延伸PCR
大肠杆菌
发酵
定点突变
原文传递
题名
利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌
被引量:
5
1
作者
闫继爱
张雪
张芸
左佃光
陈宁
温廷益
机构
天津科技大学生物工程学院
中国科学院微生物研究所
出处
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第3期79-84,共6页
基金
国家"863"计划(2006AA02Z216)资助项目
文摘
利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065L-苏氨酸的产量为5.55±0.51g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065L-苏氨酸产量为9.77±1.83g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065L-苏氨酸产量为8.65±1.42g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。
关键词
大肠杆菌
RED同源重组
基因敲除
L-苏氨酸
发酵
Keywords
E.coli Red recombination Gene knockout L-Threonine Fermentation
分类号
Q784 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响
被引量:
11
2
作者
张雪
闫继爱
于雷
张国强
张芸
陈宁
温廷益
机构
天津科技大学生物工程学院
中国科学院微生物研究所
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第5期591-596,共6页
基金
国家“863计划”(2006AA02Z216)~~
文摘
【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒,将其转入野生型大肠杆菌W3110,分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时,对L-苏氨酸积累的影响。【方法】以W3110染色体DNA为模板,PCR扩增苏氨酸操纵子基因,即启动子THrLp、编码前导肽基因thrL以及thrA、thrB、thrC基因,通过重叠延伸PCR的方法对thrA基因定点突变,解除苏氨酸对它的反馈抑制,构建出重组表达质粒pWYE112和pWYE134,5L发酵实验测定L-苏氨酸的产量。【结果】经5L发酵罐发酵产酸实验,W3110的L-苏氨酸产量为0.036±0.004g/L,携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110菌株L-苏氨酸产量为2.590±0.115g/L,质粒上thrA解除反馈抑制后,L-苏氨酸的产量增加到9.223±1.279g/L。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使L-苏氨酸积累,进一步解除thrA基因的反馈抑制,可以增强L-苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。
关键词
L-苏氨酸
重叠延伸PCR
大肠杆菌
发酵
定点突变
Keywords
L-threonine
gene splicing by overlap extension PCR
Escherichia coli
fermentation
site-directed mutation
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌
闫继爱
张雪
张芸
左佃光
陈宁
温廷益
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2010
5
原文传递
2
含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响
张雪
闫继爱
于雷
张国强
张芸
陈宁
温廷益
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009
11
原文传递
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