代谢改造黑曲霉合成乙酰氨基葡萄糖

该研究以黑曲霉为底盘细胞,首先敲除N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)摄取相关转运蛋白ngtA编码基因,获得GlcNAc的吸收利用缺陷型菌株,有利于胞外GlcNAc的积累。在此基础上,通过表达大肠杆菌来源的卤酸脱卤酶样磷酸酶编码基因yqaB,构建黑曲霉GlcNAc的完整合成途径,实现GlcNAc的合成,产量为1.78 g/L。通过共过表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因gnaA和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因gfaA强化GlcNAc合成途径,GlcNAc的合成水平提升至3.64 g/L。为增加GlcNAc合成前体GlcNAc6P的胞内供给,利用RNA干扰技术对乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc6P)分解代谢途径中氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶基因nagB和乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA基因表达进行弱化表达,GlcNAc产量进一步提高至4.03 g/L。为减弱黑曲霉糖酵解途径与GlcNAc合成途径竞争共同前体物质果糖-6-磷酸,对磷酸果糖激酶基因pfkA进行弱化表达,GlcNAc的最终产量为4.61 g/L。

代谢工程改造黑曲霉生产葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是葡萄糖的一种二元羧酸衍生物,是重要的平台化合物,被应用于医药、化工等领域。本研究以黑曲霉为底盘细胞,通过表达来自恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的糖醛酸脱氢酶基因ppudh,成功在黑曲霉中实现了葡萄糖二酸的合成,产量为18.74 mg/L;在此基础上通过共过表达黑曲霉自身来源的肌醇加氧酶(anmioxA)和肌醇-1-磷酸合酶(aninoA)、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的羧酸转运蛋白(scJEN1),强化了合成通路和外泌途径,将产量提高至102.10 mg/L;通过表达来自乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363的NADH氧化酶(llnox),建立NAD~+辅因子循环系统,使产量进一步提高至115.65 mg/L;利用RNA干扰技术对竞争支路中的关键酶磷酸果糖激酶(pfkA)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)进行弱化表达,葡萄糖二酸最终的产量达到313.65 mg/L。本研究为微生物高效生产葡萄糖二酸和下游相关产品生产奠定基础。