草地早熟禾荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选出草地早熟禾实时荧光定量中的最适内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析检测6个传统内参基因ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α、18s rRNA和β-tublin在草地早熟禾不同组织器官、叶片不同发育期、非生物胁迫和不同激素诱导下mRNA的表达差异情况。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件综合评价6个候选内参基因的表达稳定性。结果表明,在不同组织、叶片不同发育期、激素诱导和非生物胁迫下,候选内参基因的表达稳定性存在差异。GAPDH在草地早熟禾不同组织器官中表达最为稳定;EF-1α在非生物胁迫下表达最为稳定;不同激素下首选β-tublin;在叶片不同发育期ACT表达最为稳定。综上所述,通过筛选出不同条件下适宜的内参基因不仅有助于提高草地早熟禾基因表达分析的准确性,也为早熟禾属植物其他内参基因的开发提供了理论参考。

草地早熟禾查尔酮合成酶基因PpCHS1克隆、功能与表达分析

以草地早熟禾转录组数据为基础,克隆得到PpCHS1基因cDNA序列。其包含查尔酮合成酶基因(CHS)家族保守区域,与山羊草、大麦等植物的查尔酮合成酶基因相似度高;属于疏水性蛋白,Ⅲ型聚酮合酶,具有同源二聚体结构,亚细胞定位结果显示基因编码的蛋白定位于细胞质。通过对PpCHS1进化和表达分析表明,其功能可能与花发育相关并能促进黄酮类物质的合成,受紫外线和高盐的诱导,同时在外施MeJA下持续高表达,推断PpCHS1可能参与非生物胁迫与生物胁迫的防御。

草地早熟禾PpGA20ox1基因的克隆及表达分析

利用RACE方法,从草地早熟禾叶片中克隆出1个GA20ox基因家族成员的cDNA序列,命名为PpGA20ox1,提交到Genbank,登录号为KX443595。PpGA20ox1开放阅读框长1095bp,编码含364个氨基酸的蛋白质序列;不含信号肽序列,为疏水蛋白,与黑麦草、小麦等物种的亲缘关系较近;用Gateway方法构建瞬时表达载体并注射烟草叶片观察亚细胞定位,发现其定位在细胞质和细胞核。用相对荧光定量qPCR方法研究基因的组织特异性及喷施赤霉素和烯效唑对基因表达的影响,结果表明PpGA20ox1基因在草地早熟禾叶片中表达量最高,根次之,叶鞘最少,且表达量受赤霉素和烯效唑抑制。