关注自体造血干细胞移植全程管理及关键技术问题的优化研究

自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation,auto-HSCT)是利用患者自身的造血干细胞进行移植的治疗方法,广泛用于治疗多种恶性和非恶性血液肿瘤以及部分其他系统的疾病[1-3],它显著延长了疾病的无病生存时间,甚至部分疾病获得临床治愈。因此针对auto-HSCT进行全程管理,在提高auto-HSCT的成功率和安全性、降低医疗费用、减轻患者负担等方面具有重要的意义。

自体造血干细胞移植临床应用面临的科学问题及展望

自体造血干细胞移植常用于治疗多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、低危组急性粒细胞白血病,适应证目前已经拓展至某些遗传性血液系统疾病以及自身免疫性疾病。自体造血干细胞的动员、采集、冻存及复苏等质量控制对于移植的成功率非常重要,未来针对造血干细胞质量控制相关的研究会进一步的深入和优化。现阶段,中国的自体造血干细胞移植数量较欧美仍较少,但随着各移植中心技术的成熟,移植医生对移植患者年龄的主动拓展、对移植前化疗方案的优化更新,预处理方案的选择和优化,以及移植后的系统管理,自体造血干细胞的成功率和安全性将得到进一步的提高。基于此,我们推测中国自体造血干细胞移植未来的数量和质量将会大幅度的提升,而与此相匹配的相关科学问题将成为未来临床科研工作者面临的挑战和机遇。

成人复发/难治性费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病的免疫治疗进展

酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)联合标准化疗显著提高了费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia,Ph^(+)-ALL)患者的预后,化疗联合第一代或第二代TKI治疗Ph^(+)-ALL患者的3年总生存(overall survival,OS)率为40%~60%,联合第三代TKI如帕纳替尼,其6年OS率可达75%。但是,复发/难治性Ph^(+)-ALL患者在初次挽救性治疗后2年OS率仅为20%,这需要探索新的治疗策略如免疫治疗。免疫治疗主要包括单克隆抗体的使用如贝林妥欧单抗(抗CD3和CD19双特异性抗体)、奥加伊妥珠单抗(抗CD22单克隆抗体),以及针对不同靶点的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)疗法。然而,免疫治疗后长期生存期改善有限,一般建议患者达到完全缓解后桥接异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)。目前部分研究表明allo-HSCT能降低Ph^(+)-ALL复发率,但对基于免疫治疗后桥接alloHSCT能否改善患者OS尚存在争议,需要进一步开展研究。本篇综述将主要讨论近年来免疫治疗在成人复发/难治性Ph^(+)-ALL中的显著进展,期望为提高复发/难治性Ph^(+)-ALL患者的缓解率和改善预后提供一些帮助。

研究者发起的临床研究在临床专业学位研究生教学中的作用和应用策略探讨

随着我国卫生事业的快速发展,医学专业型人才的需求不断增加。医学专业学位研究生的培养越来越受到重视,但其培养模式仍不完善,需要不断探索。本文阐述了临床专业学位研究生培养过程中面临的问题和不足,提出将研究者发起的临床研究作为教学工具,用于临床专业学位研究生的培养,以期培养出具有独立临床科研思维,具有创新能力、团队协作能力和沟通能力的新型医学科研型人才。

一例遗传性骨髓衰竭综合征中RTEL1基因新突变的研究

本研究旨在探究端粒酶RTEL1(regulator of telomere length 1)突变导致遗传性骨髓衰竭综合征发生的机制以及RTEL1的生物学功能.本研究基于临床上一例男性儿童先天性角化不良患者展开,通过对患者外周血样本进行外显子测序确定存在RTEL1突变.我们成功构建了过表达野生型RTEL1(RTEL1-WT)以及突变型RTEL1(RTEL1-MUT)的293细胞系.通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)探究该突变对细胞增殖的影响,并发现RTEL1-MUT的表达影响细胞的增殖.通过免疫沉淀以及质谱技术寻找到了与RTEL1相互作用的蛋白HSP90,通过western blot对相互作用进行了验证,并发现该突变导致二者的相互作用减少.使用HSP90抑制剂STA-9090处理过表达RTEL1-WT以及RTEL1-MUT的293细胞系,发现HSP90的活性影响RTEL1的稳定性.因此,该患儿的RTEL1突变可能通过影响细胞增殖而导致先天性角化不良的发生,而RTEL1功能的改变可能源于突变影响了与HSP90的相互作用,从而影响了RTEL1的稳定性.

B细胞非霍奇金淋巴瘤小鼠模型的建立

背景与目的:近年来非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)发病率呈上升趋势,其中侵袭性NHL占了很大的比例,然而传统化疗方案提高NHL疗效的空间有限。本研究旨在建立淋巴瘤小鼠模型,为探讨治疗NHL新方案并研究其药物作用机制提供动物模型。方法:应用人弥漫大B细胞NHL细胞株SU-DHL-4及人Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi,经尾静脉注射入SCID小鼠体内,探索建立淋巴瘤小鼠模型的条件及特点。Daudi淋巴瘤小鼠分为对照组及美罗华治疗组,观察小鼠的发病情况及生存时间。结果:SU-DHL-4淋巴瘤小鼠在中位时间39.5d后开始发病,主要表现为精神萎靡、消瘦、竖毛、活动迟缓,于小鼠腹腔、尾部或后肢部位出现肿块,未发现肝脏、脾脏、骨髓等脏器出现淋巴瘤细胞浸润。Daudi淋巴瘤小鼠于中位时间30.5d发病,出现双后肢瘫痪,于瘫痪后9.5d左右死亡。Daudi淋巴瘤小鼠的脏器大多受淋巴瘤细胞的累及,骨髓中出现大量Daudi细胞浸润。美罗华治疗使小鼠骨髓中的Daudi细胞呈现明显的凋亡形态。对照组Daudi淋巴瘤小鼠的中位瘫痪时间及生存时间分别为30.5d及40d,美罗华治疗组的小鼠分别为52.5d及76.5d,美罗华治疗组小鼠的中位瘫痪时间及生存时间显著延长(P<0.05)。结论:应用SU-DHL-4细胞及Daudi细胞均可以成功建立B细胞NHL小鼠模型。

中药祛脂素对再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞脂肪分化的干预

背景：祛脂素为复方中药制剂，其化学成分包含维生素A、胡萝卜素、芸香甙及槐甙A、B、C和生物碱等，可抑制脂肪细胞分化成熟。骨髓间充质干细胞可定向分化为脂肪细胞，因此可将其作为阻止骨髓脂肪化、成为治疗再生障碍性贫血的一个可能靶点。目的：观察复方中药祛脂素对再生障碍性贫血骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的干预效果。设计、时间及地点；细胞观察，于2006—06／2007—03在大连医科大学附属二院血液风湿科实验室完成。材料：骨髓间充质干细胞来自12例再生障碍性贫血患者。祛脂素为本科室辅助治疗再生障碍性贫血的科内中药验方，主要含五灵脂、槐花米和山楂，每毫升相当于原中药材1g的糊状药液。方法：抽取患者骨髓液，Ficoll＋贴壁法分离培养骨髓单个核细胞，达70％～80％融合后扩增传代。取传至第3代的骨髓间充质干细胞，分为2组：脂肪细胞诱导组向含有10％FBS的DMEM培养体系中加入终浓度为0．5μmol／L氢化可的松、1μmol／L地塞米松、10mg／L牛胰岛素；祛脂素组在其基础上加入终浓度为1g／L的祛脂素，培养14d。主要观察指标：计算脂肪细胞阳性率。采用RT-PCR及Western blowing法测定细胞内PPARγmRNA、蛋白水平的表达。结果：与脂肪细胞诱导组比较，祛脂素组脂肪细胞阳性率、细胞内PPARγmRNA水平、PPARγ蛋白水平均明显下降（t=18．6，P〈0．01：t=189．64，P〈0．01；t=15．93，P〈0．01）。结论：祛脂素对再生障碍性贫血的骨髓间充质干细胞脂肪分化具有抑制作用，通过减少脂肪细胞形成、降低脂肪细胞特异性标志PPARγ的转录及蛋白表达，帮助恢复骨髓造血功能。

高剂量阿糖胞苷治疗急性髓细胞白血病的决策与争议

急性髓细胞白血病是(AML)一组异质性疾病,首先需要根据细胞遗传学、分子生物学进行危险度分层,以指导缓解后的治疗,提高生存时间,改善预后。高剂量阿糖胞苷是缓解后巩固化疗方案的主要药物之一,尤其针对合并CBF-AML等预后良好因素的AML患者,具有分子生物学缓解率高、疗效确切的特点。虽然造血干细胞移植在中、高危组AML患者中,异基因造血干细胞移植仍为缓解后的首选治疗方式,但是对于,低危AML及无条件做移植的患者,大剂量Ara-C巩固化疗是良好的治疗选择。对于HD-Ara-C的适用患者群、剂量、疗程等问题仍存在一些争议,需要进一步开展临床研究明确上述争议的问题。

恶性血液肿瘤患者知情不同意的原因及应对策略

知情同意权可以让患者及家属在充分了解疾病的基础上,与医生共同做出有利于疾病治疗的决策,保障患者诊疗上最大获益。然而,知情不同意严重影响恶性血液肿瘤患者的诊治疗效,是导致患者治疗失败的重要原因之一。诊治过程中知情不同意原因主要来源于患方、医方、社会三方面多种因素的影响和干扰。为了减少知情不同意的发生,应该注重加强医患沟通能力,提高医务人员的专业和人文素质;丰富患者及家属的医学专业知识,搭建“医护-患者-家属”共同应对血液肿瘤性疾病的诊治模式。这对于提高诊疗过程中患者的依从性以及治疗效果具有重要意义。

短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子对小鼠外周血造血干细胞的动员作用

背景:外周血造血干细胞用于损伤组织的修复及再生需要快速有效的动员方法。常规的动员方案多采用重组人粒细胞-集落刺激因子或大剂量化疗联合重组人粒细胞-集落刺激因子,该方案耗时长、程序复杂。目的:对常规的外周血造血干细胞动员方案进行改进,观察短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子动员KM小鼠外周血造血干细胞的效果。设计、时间及地点:于2006-09/2007-03在大连医科大学附属第二医院血液科实验室开展的随机对照动物实验。材料:雄性8周龄KM小鼠24只,以给药方式分为3组:常规给药组、短程高剂量给药组、生理盐水对照组。方法:常规给药组,皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子,0.2μg/次,2次/d,共6d;短程高剂量给药组,前4d注射等量生理盐水,后2d皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子,2.5μg/次,2次/d;生理盐水对照组,每日注射等量生理盐水,共6d。主要观察指标:各组小鼠外周血白细胞计数、粒-巨核细胞集落数。结果:常规剂量组及短程大剂量组小鼠外周血白细胞迅速增高,对照组无明显变化。粒-巨核细胞集落培养7d后,常规剂量组和短程高剂量组的粒-巨核细胞集落计数较对照组显著升高达50倍以上(P<0.01),常规剂量组和短程高剂量组两组间比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子动员小鼠外周血造血干细胞,有着良好的可行性及有效性。

诊疗方案修订迫切需要伦理论证

伦理论证通过对医学诊疗方案的科学性、安全性及患者权益等方面的严格审查控制研究风险,保障临床实践规范进行。充分的伦理论证在保障患者利益的同时,同样保护着医生的权益,是医学科学健康发展的重要保障。在基础研究、新药研发飞速进展的推动下,医学临床研究在蓬勃发展的同时衍生出众多医学伦理问题,亟待引发研究者重视。以精准医学为导向的现代医学所引发的社会、经济等多方面伦理挑战,决定了伦理论证的紧迫性。

导言：急性髓细胞白血病诊治的优化选择

急性白血病（Acute leukemia,AL）是发生于造血干细胞的克隆性恶变,导致大量白血病细胞无限制地分裂增殖,不能发生程序性凋亡,从而导致骨髓及外周血中大量白血病细胞积聚,进一步抑制正常造血细胞的发生及发育,而呈现贫血、出血、严重感染等临床表现,及全身脏器的广泛浸润,比如浸润至肝、脾、淋巴结等组织器官。按照造血干细胞细胞系别发生恶变的不同,白血病分为急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病（Acute myelogenous leukemia,AML）。

大剂量阿糖胞苷治疗急性髓细胞白血病疗效及不良反应观察

为探讨大剂量阿糖胞苷(Ara-c)用于急性髓细胞白血病(AML)完全缓解后巩固强化治疗的疗效及不良反应,本文分析5例AML患者,在治疗前完善细胞遗传学及分子生物学检查,经诱导治疗达到完全缓解(CR)后,即给予大剂量Ara-c(Ara-c 3g/m2,12小时1次,共6次)单药强化治疗共3疗程,每次化疗前均进行骨髓穿刺、分子生物学检查等判断治疗效果,观察15例次的治疗效果及不良反应。之后所有患者均持续完全缓解,并且早期达到分子生物学缓解,所有患者均出现明显的骨髓抑制及不同程度的感染、消化道反应等,但均安全度过,不影响进一步治疗。本研究提示大剂量Ara-c作为AML缓解后的巩固强化治疗方案,疗效确切、分子生物学缓解率高、安全性好。

急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因筛查及实时定量检测平台的建立

目的:针对90%以上的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者表达的PML/RARα融合基因,设计引物及探针。对APL患者进行基因筛查,并构建PML/RARα环形质粒作为标准品,建立APL患者PML/RARα融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,为APL患者的诊治提供分子生物学依据。方法:设计PML/RARα及ABL引物及Taqman探针,对APL患者进行基因筛查。并以PML/RARαL型及S型阳性的APL患者cDNA为模板,应用PCR技术扩增出453bp和550bp基因片段,构建pMD 18TPML/RARα(L)及pMD 18T-PML/RARα(S)标准品。实时荧光定量(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术对该基因转录本水平的变化情况进行监测。结果:成功构建pMD 18T-PML/RARα质粒标准品,应用RQ-PCR技术,以ABL为内参,应用Taqman探针法,对APL患者标本进行检测,技术可行,数据稳定。结论:成功构建APL融合基因检测及微小残留病变监测的诊断平台,应用于临床病人的基因诊断,为APL的诊治提供了可靠的分子依据。

系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞生长特性与相关细胞因子的表达

背景:骨髓造血依赖于干细胞所处的造血微环境,其中基质细胞及多种细胞因子在造血中发挥着重要的调控作用。系统性红斑狼疮具有淋巴细胞亚群及相关细胞因子表达,其基质细胞及细胞因子的异常可能导致造血微环境异常,损伤造血功能。目的:观察体外培养系统性红斑狼疮基质细胞的生长特性及细胞因子白细胞介素6、白细胞介素8的表达,探讨细胞因子与系统性红斑狼疮活动的关系,阐明系统性红斑狼疮慢性病贫血可能的病理机制。设计、时间及地点:细胞学体外培养,病例-对照观察,于2008-01/12在大连医科大学附属第二医院血液风湿科及血液学实验室完成。对象:选择大连医科大学附属第二医院血液风湿科收治的活动期系统性红斑狼疮患者15例(实验组),男1例,女14例,中位年龄32(20～55)岁;合并慢性病贫血者7例,无贫血者8例。另选健康个体10名作为对照,男9名,女1名,中位年龄46(38～57)岁。方法:取系统性红斑狼疮患者及健康对照者的骨髓液分离单个核细胞培养。主要观察指标:系统性红斑狼疮患者及健康对照者骨髓基质细胞生长特性及体外培养上清白细胞介素6和白细胞介素8的水平。结果:系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞较健康对照生长及集落形成均延后,合并慢性病贫血的系统性红斑狼疮患者更加明显,集落内各细胞排列欠规整有序。与健康对照者相比,系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞体外培养上清细胞因子白细胞介素6、白细胞介素8的表达显著升高(P<0.01),并且与系统性红斑狼疮的疾病活动呈正相关。结论:由于系统性红斑狼疮基质细胞可能存在功能的缺陷,并且高表达细胞因子如白细胞介素6、白细胞介素8,损伤了骨髓微环境,最终导致系统性红斑狼疮患者造血功能异常。细胞因子可能成为系统性红斑狼疮疾病活动的标志。

23例血液病患者侵袭性真菌感染临床分析

目的:分析23例血液病患者并发侵袭性真菌感染(IFI)的宿主因素、临床特点、抗真菌治疗及疗效。方法:回顾性分析23例侵袭性真菌感染的临床资料。结果:宿主免疫功能低下是导致IFI的重要因素之一。IFI中肺部感染最多见,占82.6%(19/23例)。发热、呼吸困难、低氧血症、肺部影像学变化是IFI最常见的临床特征,也是临床观察及判断疗效的重要指标。所有IFI患者发热占87.0%(20/23例),19例肺部真菌感染病例几乎均伴有发热、呼吸困难,并发低氧血症占84.2%(16/19例)。肺部真菌感染患者均出现肺部影像学改变,其中典型的"光晕征"或"新月征"占63.2%(12/19例)。上述临床特点不具备特征性,尽快获得病原学证据比较困难。目前综合上述临床特点、按照中国IFI诊断指南是临床诊断IFI的主要方法。本研究中抗真菌治疗总有效率(痊愈加显效)66.7%,抗真菌治疗药物安全性良好。结论:免疫功能状态与IFI发生及治疗疗效相关,早期诊断IFI困难。对真菌感染进行临床分层诊治是血液病发生IFI的重要诊治模式。

急性髓细胞白血病化疗病人保护性隔离及内环境清洁的临床意义

化学治疗是除骨髓移植以外治疗急性髓细胞白血病（acute myelogenous leukemia，AML）的主要方法，需要根据病人的病情，设立具体可行的目标，制定科学合理的方案，争取达到最佳的康复效果。AML在获得完全缓解后，远期疗效主要取决于巩吲化疗的方案和疗程。目前，国际上多采用含有中等剂量或高剂量阿糖胞片的组合疗案作为巩固治疗方案，以获得较高的长期生存。然而，与传统化疗及剂量相比，中高剂量化疗会导致更加严重的感染甚至感染性休克、口腔及消化道黏膜溃烂等并发症。

Ph染色体和bcr-abl融合基因的动态监测在慢性粒细胞白血病治疗中的临床意义

目的评价Ph染色体和bcr-abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断、治疗及微小残余病变监测中的临床意义。方法应用常规染色体显带技术、半定量反转录PCR(RT-PCR)技术和实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术对20例患者Ph染色体及bcr-abl融合基因进行动态监测,随诊3年。结果 20例慢性粒细胞白血病患者,19例患者Ph染色体阳性,20例均有bcr-abl融合基因阳性,其中11例应用伊马替尼治疗患者中9例患者Ph染色体和bcr-abl融合基因消失,提示遗传学缓解率为81.8%。9例应用常规化疗的患者随诊3年,Ph染色体和bcr-abl融合基因均未转阴。结论 Ph染色体和bcr-abl融合基因动态监测对慢性粒细胞白血病患者诊断、治疗、病情监测及预后判断有重要临床意义。

PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响

目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用Western blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响。结果成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白。同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白。将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Western blot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内。与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显著抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义(P<0.05),但对K562细胞的增殖及凋亡无影响(P>0.05);PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

调控组织因子基因表达的药物筛选研究

本研究建立TF启动子转录活性的荧光素酶基因稳定细胞株,应用该细胞模型筛选调控TF基因表达的药物,并为深入研究其分子机制打下基础。构建TF启动子的一系列5′端截短型的荧光素酶报告基因质粒(包括-2174 bp^+128 bp,-684 bp^+128 bp,-247 bp^+128 bp,-201 bp^+128 bp),将质粒电转染至U937细胞中,建立表达荧光素酶报告基因的稳定细胞株。应用ATRA验证该细胞株的功能;应用bortezomib、尿多酸肽(CDA-II)等药物处理该细胞株24小时,分析荧光素酶基因活性,筛选出能够调控TF基因表达的药物。结果发现,5 nmol/L bortezomib能激活其转录活性,上调TF转录本表达水平;1 mg/ml CDA-Ⅱ抑制TF启动子的转录活性,下调TF转录本的表达水平。TF启动子逐步截短功能分析发现,bortezomib及CDA-ⅡII调控TF启动子转录活性的区域位于-201 bp—0 bp之间。结论:本研究建立了表达TF启动子荧光素酶活性的U937稳定细胞株,并筛选出能够调控TF基因转录的药物CDA-II及bortezomib,为将来筛选新药物及深入研究其分子机制打下了基础。