马山黑山羊支原体肺炎病原的鉴定

为了了解马山黑山羊支原体肺炎的病原,给马山黑山羊支原体肺炎的防控提供依据,本研究采用形态学观察、生化特性、生长抑制、PCR扩增测序和动物致病性试验对从马山黑山羊支原体肺炎病原中分离到的菌株进行鉴定,并进行药物敏感试验。鉴定结果表明马山黑山羊支原体肺炎的病原为绵羊肺炎支原体。药物敏感试验结果表明其对壮观霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、林可霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、氟苯尼考高度敏感。

山羊痘的诊断与防治

2013年11月上旬，马山县白山镇某个体山羊养殖户发生了一起以体温升高，眼鼻有脓性分泌物，呼吸急促，全身体表出现痘疹，大部分孕羊流产和高死亡率的山羊传染性疾病，造成重大经济损失。笔者根据流行病学调查、临床症状和病理变化、经实验室病原的分离和PCR检测，确诊为由山羊痘病毒引起的山羊痘，现将疾病诊断及防治情况报道如下。

2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S（GenBank登录号：JN547228）、疫苗株CV777（GenBank登录号：AF353511）和Attenuated DR13（GenBank登录号：JQ023162）的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。

山羊呼吸系统疾病病原分析

为了调查广西省某山羊场一起羊呼吸道疾病的病原,本试验采取流行病学调查、临床症状与病理变化观察、病原分离鉴定、生化试验、PCR及致病性试验等方法对病原进行分析,并根据流行病学特点和药敏试验结果进行防控。结果表明,从病死山羊的肺脏组织中分离出MS1和MS2两株革兰氏阴性的致病杆菌,分离培养或PCR检测发现支原体、流感病毒和寄生虫均为阴性。MS1菌株生化特性符合黏质沙雷氏菌,其16SrRNA基因测序结果与GenBank上登录的黏质沙雷氏菌核苷酸序列同源性达到99%以上;MS2菌株生化特性符合大肠杆菌,其16SrRNA基因测序结果与GenBank上登录的大肠杆菌核苷酸序列同源性达到99%以上,两株菌对小白鼠均具有致病性。大肠杆菌和黏质沙雷氏菌均对壮观霉素、阿米卡星、卡那霉素和新霉素高度敏感,用高敏药物卡那霉素联合地塞米松等相关措施进行治疗,收到良好效果。

2014-2018年广西6种猪主要病毒性繁殖障碍疫病流行病学调查

试验旨在了解广西猪主要病毒性繁殖障碍疫病的发生态势,为预防和控制此类疫病提供科学依据。采用RT-PCR/PCR方法对2014年3月至2018年2月采自广西的349份流产胎儿样品进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及猪乙型脑炎病毒(JEV)6种主要病毒性繁殖障碍疫病病原的检测并分析其阳性检出率在不同年份、季节之间的差异及病原混合感染情况。结果显示,2014-2017年,6种病原的猪场阳性率从高到低依次为JEV(36.00%)、PRRSV(16.00%)、PCV2(9.00%)、PRV(7.00%)、PPV(6.00%)和CFSV(5.00%),样品阳性检出率从高到低依次为JEV(27.06%)、PRRSV(6.18%)、PRV(5.88%)、PCV2(3.82%)、CSFV(2.35%)和PPV(2.35%)。季节因素对6种病毒性繁殖障碍疫病的发生有一定影响:JEV在夏季、秋季检出率较高,春季、冬季检出率较低;PRRSV一年四季检出率均较高,且无明显差异;PCV2在春季检出率较高,其次是夏季和冬季,秋季检出率较低;PRV在春季、冬季检出率较高,夏季、秋季检出率均为0;PPV在夏季检出率较高,其次是春季和秋季,冬季检出率为0;CSFV在冬季检出率最高,其次是夏季,春季和秋季检出率均为0。流产胎儿以单一感染为主,6种病毒均存在不同程度单一感染情况,单一感染率JEV最高(23.82%)、PCV2最低(0.59%);混合感染以双重感染为主,其中以2016年双重感染情况较多,且感染组合多样;三重感染情况较少、仅在2016年送检样品中发现1例,未发现四重及四重以上感染情况。调查结果表明,2014-2017年,JEV均有较高的阳性检出率,已成为广西部分猪场母猪流产最主要病毒性病原。PRRSV和PRV仍是目前引起广西猪场母猪流产的主要病毒性病原。

猪源大肠杆菌 O157：H7与 O157的差异蛋白质组学分析

为了阐述O157:H7与O157的致病力差异与蛋白质表达差异之间的关系,我们利用双向电泳技术和质谱技术对大肠杆菌两类菌株之间进行蛋白质组学差异分析。菌体蛋白经双向电泳技术分离后,利用软件Image Master TM2DPlatinum7.0对所得双向电泳图谱进行差异分析并借助质谱技术对差异蛋白质点进行鉴定,获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的菌体总蛋白的双向电泳图谱。两样品图谱差异分析结果表明,共确定了28个有效的蛋白质差异点(Av.ratio>2.0,ANOVA<0.05),经质谱鉴定将这28个差异点注释成23种蛋白质。对得到注释的23种蛋白质进行功能分类,发现7类蛋白质与致病性密切相关,即溶菌酶抑制剂、通用应激蛋白、LuxS、鞭毛蛋白以及3种外膜蛋白。本结果将为进一步研究O157:H7菌株的致病因子,探究O157:H7与其它大肠杆菌菌株的致病力差异,以及建立快速鉴别诊断O157:H7的试剂盒提供重要的依据。

广西奶水牛场隐孢子虫感染情况的调查

了解广西奶水牛隐孢子虫病的感染情况,为兽医生物安全卫生提供数据。采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法进行检测,共检测南宁、来宾等6市8个奶水牛养殖场1 009头份不同日龄的奶水牛新鲜粪样。应用形态学分类和PCR技术对分离的隐孢子虫卵囊进行种类鉴定,发现1头奶水牛呈隐孢子虫感染阳性,其卵囊通过分离纯化后,经形态学和分子生物学鉴定为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium anderso-ni)。广西奶水牛隐孢子虫感染率极低,主要是安氏隐孢子虫感染。

猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792的囊膜糖蛋白E基因克隆及生物信息学分析

为了研究开发快速、敏感、特异的猪乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)诊断试剂和免疫效果良好的猪JE基因工程疫苗,对2011年分离到的广西猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)FC792株的E基因进行克隆、测序及生物信息学分析。结果测序获得1500bp的完整FC792株E基因序列,经同源性比对及遗传进化树分析表明,FC792株为基因Ⅲ型JEV毒株,且属于弱毒株。应用在线软件SignalP 4.1对FC792株E蛋白进行信号肽的预测,结果预测到FC792株E蛋白不存在信号肽。应用在线软件NetNGlyc 1.0预测到FC792株E蛋白存在1个N-糖基化位点:154-NYSA,线软件NetPhos 2.0预测到其存在如下磷酸化位点:丝氨酸(Ser)有10个位点;苏氨酸(Thr)有6个位点;酪氨酸(Tyr)有5个位点。应用在线免疫信息学软件预测到FC792株E蛋白有16个B细胞抗原优势表位(分值(score)≥0.85),5个CTL抗原表位,10个Th抗原表位。应用在线软件GOR4预测FC792株E蛋白的二级结构,发现α-螺旋区域占21.20%,延伸链区域占30.40%;无规则卷曲区域占48.40%。应用在线软件SWISS-MODEL对FC792株E蛋白进行三维结构预测的同源模建,结果可见FC792株E蛋白存在大量的无规则卷曲和延伸链区域,并有多个α-螺旋区域,它们螺旋扭转卷曲形成近似左右对称的2个亚基的二聚体空间立体结构。研究结果为今后研制猪JE诊断抗原和猪JE基因工程疫苗提供参考借鉴。

10株广西猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列的遗传变异分析

为了解广西猪群猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以PCV3阳性DNA为模板,利用PCR的方法分2段扩增PCV3全基因序列并进行拼接,获得10株PCV3全基因组序列,全长均为2000 bp。10株广西PCV3全基因组序列之间的核苷酸同源性为98.6%~99.8%。与国内其他毒株的同源性为97.9%~99.8%;与国外其他毒株的同源性为98.8%~99.7%。10株广西PCV3 Cap基因的大小均为645 bp,编码214 aa。PCV3 Cap基因比较保守,10株广西PCV3 Cap基因与参考株相比,仅存在散在的突变位点。基于PCV3全基因和Cap基因构建的遗传进化树显示,两者结果基本相同,10株广西PCV3处于3a和3b两个亚群。本试验表明,广西地区猪群中流行的PCV3至少存在2个亚群,不同亚群PCV3毒株的致病性差异还有待进一步的研究。

一例猪圆环病毒3型引起母猪流产病例的诊断和分析

2018年11月广西一存栏1 000头母猪的规模化猪场出现多头怀孕后期母猪流产现象,并将2窝流产胎儿送实验室进行检测。为了解引起母猪流产的病因,实验室采用细菌分离培养方法进行细菌分离鉴定;采用PCR/RT-PCR检测的方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪乙脑病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3。结果在流产胎儿内脏组织中未分离到细菌;2窝流产胎儿内脏组织中均检测到PCV3,而其他病原均为阴性,表明PCV3感染可能是引起本次母猪流产的主要原因。

戊型肝炎疫苗研究进展

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的病毒性肝炎,是一种重要的人兽共患传染病,呈全球分布,严重危害人体健康和动物养殖业健康发展。HEV有4种基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型),但HEV只有1种血清型,因此应用HE疫苗进行免疫预防是最为经济、有效、可行的防控手段。迄今HEV尚不能在体外细胞中进行稳定的大量培养,从而阻碍了HEV灭活疫苗和弱毒疫苗的研制,目前HE疫苗研究重点方向是基因工程疫苗的研发。论文就4种HE基因工程疫苗(重组HEV样颗粒疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗和转基因植物可食疫苗)的研究进展做一综述。

8株鸽源新城疫病毒广西分离株HN基因的遗传进化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的8株鸽源NDV广西分离株HN基因进行扩增、序列测定和分析,旨在探讨广西鸽源NDV HN基因的分子进化特点,为科学防控鸽源新城疫提供依据。结果显示,8株鸽源NDV广西分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp,编码571个氨基酸,属于强毒的C群,符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示,8株鸽源NDV分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为90.4%~99.5%。遗传进化分析显示,8株鸽源NDV广西分离毒株与我国2011-2013年广西、广东、吉林、辽宁、云南、黑龙江等地鸽源NDV分离株的遗传关系较为接近,位于同一进化树分支上,初步推测8株鸽源NDV广西分离株应属于classⅡ基因Ⅵb亚型NDV。

广西2月龄内犊奶牛隐孢子虫感染情况调查

自Tyzzer （1907）首次发现小鼠隐孢子虫（C.muris）以来,国内外学者对隐孢子虫病进行了大量研究,已在人、哺乳动物、禽类、爬行动物和鱼类等多种动物中发现15个种类的隐孢子虫感染^[1-3],其中可感染牛的隐孢子虫种为安氏隐孢子虫（C.an-dersoni小球隐孢子虫（C.parvum）、牛隐孢子虫（C.boris）、小鼠隐孢子虫（C.muris）、犬隐孢子虫（C.ca-nis）、猫隐孢子虫（C.fells）、猪隐孢子虫（C.suis）、鹿样基因型（C.deer-like genotype）和赖氏隐孢子虫（C.ryanae）^[4-5].隐孢子虫对牛的感染与牛的年龄呈正相关性[6].

猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法的建立与初步应用

[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。

猪源大肠杆菌O_(157)∶H_7菌体蛋白双向电泳方法的建立

为了建立大肠杆菌O157∶H7菌体蛋白的双向电泳技术,获得背景清晰,蛋白点分辨率高,重复性好的双向电泳图谱。对双向电泳技术中的样品制备方法、上样量、染色等关键步骤进行了优化。最终选用冰浴超声(9s/间隔9s,200w)3min,再置4℃24h后离心提取蛋白样品,以上样量为0.5mg菌体蛋白在pH值4-7的24cm IPG胶条上进行电泳,最后用考马斯亮蓝G-250染色,获得了较好的双向电泳图谱,得到了850±20个蛋白质点,蛋白主要集中在pH值4.06-7.53之间,匹配率为95.3%。随机选取10个蛋白质点进行质谱鉴定,检出率100%,10个蛋白质除了一个蛋白质为假定蛋白以外,其他蛋白质分属于乙酰辅酶A合成、能量代谢、氨基酸代谢等代谢途径。建立的大肠杆菌O157∶H7菌体蛋白双向电泳方法,为开展大肠杆菌O157∶H7强弱毒力菌株的差异蛋白质组学研究奠定了基础。

一例多种病毒混合感染引起母猪繁殖障碍的实验室诊断

2014年4月初，广西某猪场送检流产母猪病料，畜主描述1周内猪场多头母猪流产，使用多种药物治疗无效。为能明确病因，根据发病情况、剖检病变，采集剖检流产母猪肺脏、淋巴结、脾脏等病料于广西兽医研究所病毒室进行实验室检测，结果确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）和圆环病毒2型（PCV2）多病毒混合感染导致的母猪流产。

广西水牛和奶牛寄生虫感染情况的调查

采用沉淀法、饱和蔗糖溶液漂浮法和全血PCR等方法检测广西13个市县的散养水牛新鲜粪样1120头份、全血508头份;圈养奶水牛新鲜粪样和全血各54头份;11个黑白花奶牛规模场奶牛新鲜粪样1832头份、全血628头份。结果发现,感染广西水牛和奶牛的主要寄生虫种类有前后盘吸虫、肝片形吸虫、线虫、艾美耳球虫和安氏隐孢子虫。调查未发现牛巴贝斯虫和伊氏锥虫的感染。表明防控吸虫病的传播和发生是广西牛寄生虫病的防治重点。

仔猪腹泻性大肠杆菌蜂胶灭活菌苗的研制及应用

为研究猪场大肠杆菌蜂胶灭活菌苗对仔猪大肠杆菌性腹泻的防治作用,对广西某中型养猪场发生哺乳仔猪持续性腹泻病例进行流行病学调查和实验室诊断。从腹泻仔猪的肾脏、肠系膜淋巴结等内脏器官中分离到病原菌,经生理生化、培养特性、形态特征鉴定为大肠杆菌。药敏试验结果表明,分离菌株对环丙沙星、恩诺沙星、利福平、新生霉素、复方新诺明、奥普托欣、克林霉素、万古霉素等24种药物均耐药,占试验药物的68.57%。以分离菌株为制苗菌株,经培养灭活后,以蜂胶为佐剂,研制出本场大肠杆菌蜂胶灭活菌苗,对产前15 d的妊娠母猪进行免疫,仔猪通过母乳获得母源抗体来预防大肠杆菌性腹泻。临床应用表明,该菌苗使用安全、免疫效果良好,可显著降低哺乳仔猪持续性大肠杆菌性腹泻的发病率,提高哺乳仔猪成活率,降低药物治疗成本及耐药性的产生,是预防仔猪大肠杆菌性腹泻的有效措施。

羔羊奇形变异杆菌与支原体混合感染的诊断

2014年8月6日,实验室接诊了一起以初生羔羊发病而死亡的病例,经流行病学调查,临床症状、病原学分离鉴定,诊断为奇形变异杆菌与绵羊肺炎支原体混合感染,现报道如下。1流行病学调查该养殖户现有存栏150多只,免疫过山羊痘、口蹄疫和梭菌三联四防苗,此前部分成年羊有流涕、咳嗽现象,但羊群没有出现发病和死亡的现象。2014年4月份后,产出的羔羊有如下表现：羔羊出生后的第1~2d活泼、强壮,第3d后出现不吃,四肢无力、卧地不起等现象,其他未见异常。

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立

为了对猪场中猪肺炎支原体的感染和发病情况进行有效病原学监测,根据Genbank中猪肺炎支原体(Mhp)基因组序列,设计合成针对P46基因的1对特异性引物,经特异性试验表明,其对猪鼻支原体、猪絮状支原体、鸡毒支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的扩增结果为阴性;敏感性试验表明,其最低检出量为0.675 ng的基因组DNA;临床初步应用证明该方法可满足临床上对猪肺炎支原体的快速检测要求。