人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的 在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11（ rhIL-11），便于进一步开发。方法 以人工设计合成的 rhIL-11基因，构建表达载体 pPICZα A-IL-11，经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株 KM71，甲醇诱导表达，用 ELISA和 SDS-PAGE检测发酵上清中 IL-11的抗原性和表达量，用 IL-11依赖的 B9-11细胞株分析其生物学活性，采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的 IL-11。 结果 序列分析表明，克隆载体中 IL-11人工基因序列与设计相符；基因工程菌株 KM71-2424在摇瓶培养上清中 IL-11的表达量超过 60 mg/L，生物学活性测定显示其比活性为 5.5× 107 U/mg，而标准品的生物学活性为 2.2× 107 U/mg。经过三步层析纯化得到电泳纯的 rhIL-11蛋白质。结论 成功获得 IL-11人工基因和稳定分泌重组蛋白的基因工程菌株 KM71-2424，该重组蛋白的生物学活性显著高于大肠杆菌表达的标准品，并获得较高纯度的重组蛋白。

弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并以SDS -PAGE和Westernblotting进行鉴定。 结果 1、在我们比较的 783个碱基中 ,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同 ;2、得到一分子量为 5 4kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 38%。结论 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异 ;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的进行弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)融合基因的克隆与表达,为弓形虫ROP2-P30基因工程复合抗原的制备做准备。方法半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段,克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中,经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上,鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus(DE3)-RIL,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段,成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30,该质粒经PCR和酶切鉴定,与预期结果一致,并在大肠埃希菌中高效表达,产生相对分子质量(Mr)约为69 000的重组目的蛋白。结论弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功,并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组嵌合抗原免疫血清的制备与鉴定

目的制备与鉴定弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)重组嵌合抗原的特异性免疫兔血清。方法将已构建的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,分离上清液和包涵体,包涵体用2mol/L和4mol/L尿素梯度洗涤去杂蛋白,最后用8mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体,进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),割胶回收目的蛋白,研磨成乳浊状后以背部多点注射免疫大白耳兔,制备免疫兔血清,以免疫扩散试验检测生成的特异性抗体,间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析免疫血清的抗体特异性。结果免疫结束后,通过对流免疫扩散试验检测到了针对rROP2-P30的特异性抗体,间接ELISA法测定到其抗体滴度最高可达1∶12800,Western blotting分析结果表明,此免疫血清与可溶性的重组蛋白、包涵体形式的重组蛋白均能特异性结合。结论得到了针对rROP2-P30重组嵌合抗原的特异性免疫血清。

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段,克隆至表达载体pET22b中,导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段,克隆至质粒pUC119中,经PCR和酶切鉴定后,进行DNA序列测定,并以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上,重组质粒pET22b-ROP2转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株中,经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1.0kb的ROP2基因片段,构建成功重组质粒pUC119-ROP2,经DNA序列分析与已报道序列基本一致,重组质粒pET22b-ROP2在大肠杆菌中表达,产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达,构建成功的重组质粒pUC119-ROP2可用于下一步多基因融合的克隆操作。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组复性后体外免疫反应性研究

目的分析基因工程生产的弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)的体外免疫反应性,并对表达产物进行复性处理以获得表达产物的天然构象,为体内免疫学活性的研究作准备。方法重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经IPTG诱导的表达产物超声破壁后,SDS-PAGE分析表达产物的表达形式,对产生的重组蛋白ROP2-P30过Sephadex G-25交联葡聚糖柱,经尿素梯度洗脱进行目的蛋白的复性,通过免疫共沉淀反应及免疫印迹实验检测其复性后的重组蛋白的免疫反应性。结果重组质粒pET28b/ROP2-P30在大肠杆菌中以融合形式表达,融合表达的产物主要以包涵体形式存在,该重组蛋白复性后具有明显的免疫反应性。结论利用SephadexG-25交联葡聚糖柱尿素梯度可以复性重组的弓形虫复合蛋白ROP2-P30,该蛋白复性后体外具有免疫反应性,可用于进一步开展弓形虫病复合型疫苗的研制工作。

透明质酸酶在弓形虫重组融合抗原ROP2-P30基因免疫中的免疫增强作用

目的:研究透明质酸酶在弓形虫重组融合抗原ROP2-P30基因免疫中的免疫增强作用,初步探讨透明质酸酶在提高质粒DNA分子免疫效应中的应用潜能。方法:弓形虫重组质粒pcROP2-P30联合透明质酸酶以及单独的重组质粒pcROP2-P30肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,生理盐水和空质粒载体pcDNA3.1作阴性对照免疫,免疫3次,间隔3周。免疫结束后,以纯化的弓形虫重组蛋白ROP2-P30(rROP2-P30)为检测抗原,检测各免疫组小鼠血清中特异性抗体的形成;cell counting kit-8(CCK-8)检测免疫鼠脾细胞的增殖活性;硝酸还原酶法检测免疫鼠脾细胞培养上清中NO的含量。结果:pcROP2-P30+透明质酸酶免疫组特异性抗体生成水平显著高于其它免疫组(均P<0.01);pcROP2-P30+透明质酸酶免疫组小鼠脾细胞受特异性抗原rROP2-P30刺激后,其淋巴细胞的增殖明显高于单独的质粒pcROP2-P30免疫组(P<0.01);pcROP2-P30+透明质酸酶免疫组脾细胞培养上清中免疫活性分子NO的含量也显著升高(均P<0.01)。结论:透明质酸酶在提高弓形虫DNA免疫效应方面显示了免疫增强作用,具有发展成为基因免疫的免疫佐剂的潜能。

人胎盘碱性磷酸酯酶基因在鸡蛋蛋清中的表达

利用PCR方法从pSEAP2-control质粒中扩增获得人胎盘碱性磷酸酯酶基因plap的cDNA,将其克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)的卵清蛋白基因调控区下游。通过脂质体精子载体法人工授精母鸡,收集鸡蛋、孵化。雏鸡出壳后,抽提鸡冠基因组DNA,采用PCR方法检测两组孵化后代中的嵌合体鸡,第1组母鸡(95羽)中plap的PCR阳性检出率为75%,第2组母鸡(128羽)的阳性检出性率为81%。经Western blotting检测,仅1只嵌合体母鸡所产鸡蛋蛋清中检测到plap产物的存在。

CSN4基因干扰对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

乳腺癌目前是危害女性常见的恶性肿瘤,研究发现COP9复合体中的各个亚基与恶性肿瘤的发生发展密切相关,且CSN4亚基对整个复合体具有很重要的调节作用。为探讨CSN4基因在乳腺癌细胞中的生物学功能及其分子作用机制,本研究首先在乳腺癌细胞MDA-MB-231中,成功建立了慢病毒介导的CSN4基因的干扰表达体系,并通过细胞表型实验、CCK8实验和细胞克隆形成实验证实CSN4基因表达的干扰能显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖速率和克隆形成能力。流式细胞检测结果表明,干扰CSN4的表达能显著增加Sub G_1期乳腺癌MDA-MB-231细胞比例;凋亡检测结果表明,干扰CSN4的表达能显著增加早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例,这证明干扰CSN4的表达能够促进乳腺癌细胞凋亡。最后,通过Western blot实验证实CSN4能调控CDK6和Caspase3蛋白的表达,激活Caspase3切割PARP,揭示CSN4可调控CDK6和Caspase3的表达从而影响乳腺癌细胞的增殖和凋亡。本研究结果进一步加深了人们对乳腺癌细胞凋亡和细胞生长的分子机制的认识,同时也进一步揭示了CSN4在肿瘤生物学中的作用和机制。

Jab1基因的RNAi对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的影响

为探讨Jab1基因在乳腺癌细胞中的生物学功能,进一步揭示其作用的分子机制.首先在乳腺癌细胞MCF-7中,成功建立了慢病毒介导的Jab1基因的RNAi系统,并通过CCK8细胞增殖实验和细胞划痕实验证实Jab1基因表达的干扰使得MCF-7细胞的增殖和迁移发生显著的下降,细胞周期分析表明,干扰Jab1的表达能增加MCF-7细胞sub G1期的比例,诱导凋亡;此外,通过RT-PCR和Western blot实验首次发现Jab1能调控TBHS1的表达,添加甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC能抑制Jab1表达干扰介导的THBS1表达下调,提示Jab1可通过甲基化的表观遗传学途径调控THBS1基因的表达.

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;West-ernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。

弓形虫GRA6可溶性蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫GRA6抗原,为制作弓形虫感染基因工程诊断试剂盒奠定基础。方法将重组pGEX-GRA6表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus (DE3)-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达。超声破壁后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物的表达形式,并对表达产物以硫酸铵沉淀、Sephedax G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化。通过Western blotting检测其纯化的重组抗原的免疫反应性。结果GRA6以融合蛋白(GST-GRA6)的形式在大肠埃希菌中得到了高效表达。对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达。在上清液中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上。Western blotting分析表明纯化蛋白能被弓形虫感染的人血清所识别。结论GRA6在大肠埃希菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化后能特异性地被弓形虫感染者血清所识别。

乳腺癌Jab1蛋白调控Nov基因的表达受甲基化水平影响

为探讨癌基因Jab1在乳腺癌发生发展中的功能,首先在乳腺癌细胞MDA231中建立了慢病毒介导的Jab1基因的表达干扰系统,并通过人基因表达谱芯片分析结果以及实时定量PCR实验筛选出受Jab1调控的下游基因;此外,通过实时定量PCR以及Western blot实验证实Jab1干扰表达能降低Nov基因在转录和翻译水平表达,而且Nov启动子区域存在4个高甲基化CpG位点.进一步使用甲基转移酶抑制剂处理Jab1干扰表达细胞,发现与未使用抑制剂处理细胞相比,Nov基因的mRNA和蛋白质表达水平发生明显上调,说明Jab1基因调控Nov表达受甲基化水平的影响,提示Jab1可能是通过表观遗传学水平调控Nov基因的表达.

慢病毒介导的Jab1基因表达干扰在乳腺癌细胞中功能的初步研究

在乳腺癌细胞MDA231中,成功建立了慢病毒介导的Jab1基因表达干扰系统,并通过MTT细胞增殖实验和体外细胞侵袭能力实验证实Jab1基因表达的干扰使得MDA231细胞的增殖和体外侵袭能力发生显著的下降;此外,通过Western blot实验证实Jab1对于Fra1的表达可能存在调控,并且Fra1和Jab1在MDA231细胞中的表达干扰会使细胞形态发生相似的改变,提示Jab1和Fra1在乳腺癌细胞MDA231中可能通过调控共同的信号通路影响细胞的形态.

大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达

为了对大肠杆菌中由aroG基因编码的 3 脱氧 D 阿拉伯庚酮糖酸 7 磷酸合成酶 (DAHP合成酶 )进行结构与功能的深入研究 ,尝试了aroG基因在枯草杆菌中的表达 .表达载体以pUB110为骨架 ,采用了枯草杆菌热激蛋白 groESL基因的启动子 ,碱性蛋白酶subtilisin基因的信号肽和N 乙酰胞壁酸 L 丙氨酸酰胺酶cwlB基因的转录终止子 ,将aroG基因在枯草杆菌WB6 0 0宿主菌中进行了分泌表达 .在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上可以明显看到与aroG基因表达产物分子质量一致的蛋白条带 ,并在培养基中可以检测到DAHP合成酶的活性 .