shRNA稳定干扰Raptor基因表达的小鼠胸腺上皮细胞系的建立

目的:建立Raptor基因稳定干扰的小鼠胸腺上皮细胞系(mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1)。方法:根据Sigma公司数据库Raptor基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,在其3'和5'端添加pLKO.1-puro慢病毒载体酶切位点序列,合成shRNA序列,插入载体。将pLKO.1-puro-shRNA-Raptor慢病毒载体与包装质粒混合,共同转染293T细胞,收集病毒颗粒感染mTEC1,再用嘌呤霉素对其进行筛选,最后用免疫印迹法检测Raptor,mTOR,磷酸mTOR(p-mTOR)以及mTOR下游分子核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase,p70S6k),磷酸化p70S6k(p-p70S6k)的表达水平。同时采用细胞计数和TUNEL法分别检测细胞增殖与凋亡。结果:合成的Raptor基因shRNA序列成功插入至经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pLKO.1-puro载体,经测序表明序列正确;免疫印迹结果显示,pLKO.1-puro-shRNA-Raptor感染mTEC1后,Raptor、mTOR及其下游p-p70S6k蛋白表达明显降低,但细胞增殖及凋亡无明显变化。结论:成功构建Raptor shRNA慢病毒表达载体,建立稳定的Raptor基因敲降的小鼠mTEC1。

Notch3胞内活化片段抑制小鼠胸腺上皮细胞系增殖

目的:研究Notch3信号对胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)增殖的影响。方法:人工合成Notch3胞内活化片段(NICD3)序列,构建慢病毒载体,并进行酶切和测序验证。将NICD3包装后感染小鼠TECs系m TEC1,荧光显微镜观察记录绿色荧光细胞的数量与可见光下细胞数量并计算感染效率。采用Ed U增殖试剂盒检测m TEC1细胞增殖率。结果:酶切和测序证实成功构建NICD3慢病毒表达载体,荧光显微镜观察表明该质粒能较好地感染m TEC1细胞,感染效率约为20%。Ed U增殖实验显示过表达NICD3可抑制m TEC1细胞增殖(P<0.01)。结论:Notch3信号抑制m TEC1细胞的增殖。