HIV-1 nef基因的克隆及原核表达研究

目的:构建HIV-1 Nef基因的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达,初步优化其表达条件。方法:利用特异性引物PCR扩增获得HIV-1 Nef基因片段,PCR产物经限制性内切酶双酶切后连接载体pET24a(+),构建重组质粒pET24a(+)-Nef。经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,优化表达条件,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物。结果:PCR扩增获得618bpDNA片段,酶切鉴定结果表明HIV Nef基因已克隆入原核表达载体pET24a(+)中,测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组菌诱导后可表达相对分子质量(Mr)符合预期的融合蛋白。0.1mmol/LIPTG在37℃诱导6h为最佳表达条件,重组蛋白表达量可由15.8%增加到43.9%。结论:在大肠杆菌中成功地表达了HIV Nef蛋白,并初步获得了最优化的表达条件。

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测。结果:RT-PCR扩增出了大小为543bp的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41000的蛋白。结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础。

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体,并在E.coli BL21中诱导表达。方法:从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA,经RT-PCR扩增B7-DC胞外段,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a(+)-B7-DCECD。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测。结果:获得全长为582bp的小鼠B7-DC胞外段基因,经测序证实其序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41000的B7-DC胞外段蛋白。结论:成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体,并在E.coli BL21中进行表达,为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础。

糖尿病肾病患者血浆可溶性CD146水平与动脉粥样硬化及其预后的关系

目的研究糖尿病肾病（DKD）患者血浆可溶性CD146（sCD146）水平和动脉粥样硬化及其与心血管事件的关系。方法入组自2013年1月至2015年12月于我院治疗的105例慢性肾脏病（CKD）1-3期的DKD患者（男68例，女37例），94例2型糖尿病无肾脏损伤的患者作为对照组（男64例，女30例），通过酶联免疫吸附法检测血浆sCD146水平，完善DKD患者颈部和下肢动脉的多普勒超声。对所有DKD患者进行回顾性随访（中位随访时间28个月）。Spearman法分析sCD146在对照组和CKD 1-3期DKD患者中的表达差异及其与蛋白尿、肾功能等关系。Kaplan-Meier曲线研究DKD患者sCD146与动脉粥样硬化指标的相关性及其对心血管终点事件的预测作用。结果无肾病组患者血浆sCD146水平低于CKD 1-3期的DKD组[两组sCD146分别为（435±150）、（602±274）μg/L，t=－5.246，P〈0.001），sCD146水平与血清肌酐（r=0.360，P〈0.001）以及尿白蛋白肌酐比呈正相关（r=0.225，P=0.001），与肾小球滤过率呈负相关（r=－0.376，P〈0.001），并随着CKD分期的进展而增加[CKD 1、2、3期患者的sCD146水平分别为（472±172）、（590±223）、（685±340）μg/L，F=164.203，P〈0.001]。sCD146浓度和颈动脉内-中膜厚度（r=0.577，P〈0.001）、下肢动脉内-中膜厚度（r=0.765，P〈0.001）呈正相关。sCD146浓度高的患者更易发生颈动脉斑块[OR（95%CI）=17.302（2.752-108.780），P=0.002]、颈动脉不稳定斑块[OR（95%CI）=6.404（1.036-39.608），P=0.046]和下肢不稳定斑块[OR（95%CI）=13.641（1.942-95.825），P=0.009]。血浆sCD146水平越高的DKD患者心血管终点事件的发生率更高（Log rank χ2=9.366，P=0.049）。结论sCD146可以无创敏感地反映CKD 1-3期的DKD患者肾功能的下降和动脉粥样硬化的进展，并对未来的心血管事件也有预测作用。