重组人甲状旁腺激素肽(1-34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

人工合成人甲状旁腺激素1～34肽段(PTH134)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株。经发酵、破菌、金属螯合层析、反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH134,hPTH134肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH134一致。生物学活性研究表明,hPTH134在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用。

反相高效液相色谱法测定甲肝灭活疫苗中的2-苯氧基乙醇含量

目的建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC法)测定甲型肝炎灭活疫苗中2-苯氧基乙醇的含量。方法采用C18柱,以50%乙腈为流动相,流速为1.0mL/min,检测波长为270nm,柱温为室温。以外标法测定含量。结果2-苯氧基乙醇的浓度线性范围是0.55～111μg/mL(r=0.9995),平均回收率为100.37%,RSD为1.77%。结论RP-HPLC法可用于甲型肝炎灭活疫苗中2-苯氧基乙醇的含量测定。

人白细胞介素11的定点聚乙二醇修饰

利用hIL-11无Cys残基这一特点,通过定点突变将一个Cys残基引入hIL-11的N末端。然后,利用与Cys巯基特异性反应的mPEG-马来酰亚胺将mPEG偶联到预先选定的位点,经层析纯化得到hIL-11的定点PEG修饰物。利用依赖型细胞株7TD1测定其生物学活性,结果表明,其体外生物学活性保持原有hIL-11活性的30%左右。定点聚乙二醇修饰方法为定向改造hIL-11,提高其药效的应用研究打下基础。

Ⅱ型登革病毒D01090株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育及初步鉴定

目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上进行毒种扩增和滴度测定;将D01090毒株以4.0MOI接种KMB17细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增,并连续传代10代,选育出良好的KMB17细胞适应株;病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得高浓度病毒液,接种KMB17细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化;然后经过三轮蚀斑纯化筛选出纯化病毒株,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果:以Ⅱ型登革病毒中国株D01090基因组为模板,能扩增出511bp的登革病毒特异基因和119bp的Ⅱ型登革病毒型特异性基因。病毒经C6/36细胞扩增后滴度达4.5CCID50/ml,感染KMB17细胞至第三代可产生明显的细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续传10代细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰,病毒滴度达5.0CCID50/ml;将病毒感染6天后病变达+++的KMB17细胞进行超薄切片后经透射电镜观察细胞的病理变化,镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒,细胞周围产生很多分裂的小碎片,伴有游离出胞的病毒;三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆,免疫荧光法检测病毒的抗原性呈阳性。结论选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株,经蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。

Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。