杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析

目的:探讨杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)基因在鞭毛再生中的作用。方法:通过设计简并引物及RACE法克隆了杜氏盐藻SAHase基因全长,使用pH休克法对杜氏盐藻进行鞭毛去除及再生,通过实时荧光定量PCR研究在转录水平上SAHase基因的变化。结果:所克隆的杜氏盐藻SAHase基因cDNA全长1926bp,包含ORF1458bp、3’UTR61bp和5’UTR407bp。实时荧光定量PCR结果显示,在鞭毛再生的过程中,SAHasemRNA转录量升高,其水平在3h时达到了未处理组的3倍左右。结论:杜氏盐藻的SAHase基因与鞭毛再生有关。

杜氏盐藻cDNA文库的构建及KCBP基因的克隆

目的:构建杜氏盐藻cDNA文库并从该文库中筛选类驱动蛋白钙调素结合蛋白(KCBP)基因cDNA序列。方法:取对数生长期的杜氏盐藻细胞,提取总RNA并分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,连接到pAP3neo载体上,采用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B。计算平板上单菌落数,测定文库的滴定度和重组率。运用PCR法筛选含有KCBP基因特异片段的质粒。结果:文库滴定度为5.6×106pfu/mL,重组率在90%左右,插入片段长度在0.4～6.0kb,平均长度为1.9kb。利用PCR法从该文库中筛选到了含有新基因KCBP特异片段的单菌落,经测序与cDNA末端快速扩增(RACE)-PCR获得的杜氏盐藻KCBP基因cDNA序列相符,此序列属于kine-sin-14家族。结论:成功构建杜氏盐藻cDNA文库,并从该文库筛选出一个kinesin样cDNA序列。

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。

转录因子Sp1抑制K562细胞红系分化

目的研究转录因子Sp1在K562细胞诱导向红系分化过程中的表达变化,并确定其对于红系分化及珠蛋白表达的影响。方法用定量PCR及Western blot的方法确定Sp1在红系分化过程中的表达情况。通过RNAi的方法抑制Sp1的表达,并通过联苯胺染色确定K562细胞中血红蛋白的表达情况,同时定量PCR的方法分析红系分化相关基因的表达,流式细胞技术检测红系分化过程中表面标志蛋白的表达情况。结果在hemin诱导的K562细胞以及促红细胞生成素EPO诱导的造血干细胞向红系分化过程中,Sp1的mRNA及蛋白水平均呈明显下降,提示其可能负调节红系分化过程。在K562细胞中抑制Sp1的表达则可明显提高K562细胞中的血红蛋白含量,促进γ-,ε-珠蛋白,CD71,CD235a基因的表达,同时CD71,CD235a阳性细胞比例明显增加。结论以上结果说明转录因子Sp1负调节红系分化过程,抑制Sp1的表达可提高K562细胞中珠蛋白的表达,并促进K562细胞向红系分化。

SNHG20在肝细胞癌中的预后价值及其与免疫浸润的相关性

目的研究长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因20(SNHG20)在肝癌中的表达、预后价值及其与免疫浸润的相关性。方法使用癌症基因组图谱(TCGA)数据库肝癌数据评估SNHG20在肝细胞癌中的作用。用R语言研究SNHG20在肝癌组织中的表达。通过生存分析,评估SNHG20表达对肝癌患者生存的影响。使用单因素和多因素Cox回归模型对肝癌患者的多个临床特征与生存率进行比较。采用基因集富集分析(GSEA)进一步探究SNHG20参与肝癌发生的信号通路。结果SNHG20表达增高与T分期(P=0.036)、病理分期(P=0.028)、组织学分级(P<0.001)、肿瘤状态(P=0.006)和血管侵犯(P=0.029)有相关性。此外,多因素分析显示SNHG20是影响肝癌患者预后的独立危险因素。此外,肝癌组织中细胞毒性细胞、树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞(NK)的浸润水平与SNHG20的表达呈正相关。GSEA发现KEGG DNA复制、KEGG细胞周期和KEGG Wnt信号通路在SNHG20高表达表型中显著富集,而KEGG胰岛素信号通路在SNHG20低表达表型中明显富集。结论SNHG20是一种预测肝癌预后的生物标志物,并与肝细胞癌的免疫浸润密切相关。

基于生物信息学筛选肝细胞癌血管侵袭特征基因和预后标志物

目的:挖掘肝细胞癌(HCC)血管侵袭相关的特征基因并筛选其预后标志物。方法:使用R软件limma包筛选出癌症基因组图谱数据库(TCGA)、基因表达数据库系列(GSE19977和GSE20017)中HCC血管侵袭相关差异表达基因,对其进行GO功能富集和KEGG信号通路分析。采用最小绝对收缩选择算子(LASSO)和支持向量机递归特征消除(SVM-RFE)筛选重叠的HCC血管侵袭特征基因。采用单因素Cox回归分析筛选出的特征基因与患者预后的关系。结果:3个数据库中上下调表达一致的差异表达基因有517个。GO富集结果显示3个数据库交集的差异基因主要富集于线粒体基质、核糖体,血红素结合、氧化还原酶活性等。KEGG分析结果显示交集的差异表达基因主要富集在新陈代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、补体和凝血级联等信号通路。两种算法共筛选出10个重叠的特征基因:爱帕琳肽受体(APLNR)、残疾基因同源物1(DAB1)、分泌磷蛋白2(SPP2)、甲状腺激素应答蛋白(THRSP)、溶质载体家族22成员7(SLC22A7)、溶质载体家族16成员2(SLC16A2)、内皮细胞特异性分子1(ESM1)、外泌体成分8(EXOSC8)、同源盒基因D10(HOXD10)和TB(POZ)结构域6蛋白(KBTBD6)。APLNR、SPP2、SLC22A7低表达[HR(95%CI)分别为0.85(0.71~1.02),0.87(0.80~0.95),0.89(0.82~0.97)]及HOXD10高表达[HR(95%CI)为3.26(1.84-5.77)]是HCC患者预后的危险因素。结论:APLNR、DAB1、SPP2、THRSP、SLC22A7、SLC16A2、ESM1、EXOSC8、HOXD10和KBTBD6可作为HCC血管侵袭特征基因,其中APLNR、SPP2、SLC22A7及HOXD10与HCC患者预后有关。

川芎嗪对血小板活化钙信号的影响及作用机制

分析国内外在研究川芎嗪与血小板活化时游离钙离子浓度关系方面的文献报道,为进一步研究川芎嗪的药理作用提供参考。通过检索中国知网、万方及PubMed等数据库,查阅整理上述研究领域的相关文献25篇。目前研究显示,血小板活化时血小板胞质内钙离子浓度升高,其升高取决于细胞外血小板膜外基质中的钙内流和血小板细胞内钙池的钙释放。川芎嗪主要通过抑制血小板内钙离子浓度升高,发挥抑制血小板活化的药理作用。川芎嗪抑制血小板活化的具体作用途径机制仍不明了,目前的研究大多支持川芎嗪通过抑制胞内游离钙离子浓度升高进而抑制血小板活化这一结论,但这些研究多为描述性的,缺少动态观察川芎嗪对钙离子作用的相关研究。

ACYP1在肝癌中的表达及其与预后和免疫浸润的相关性分析

目的探究酰基磷酸酶1(ACYP1)在肝癌中的表达、预后预测价值以及与免疫浸润的关系。方法利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库中基因转录表达数据分析ACYP1在374例肝癌组织中的表达,根据其中位表达水平将患者分为高表达组(187例)和低表达组(187例),以50例正常肝组织样本的表达数据作为对照组。然后进行各组差异表达、Kaplan-Meier生存分析、单因素和多因素Cox分析,评价ACYP1在肝癌诊断及生存预后中的作用。通过肿瘤免疫评估资源(TIMER)数据库分析ACYP1表达水平与免疫细胞浸润和免疫检查点之间的关系。结果ACYP1在肝癌组织中的表达水平(2.18±0.69)高于正常肝组织(1.02±0.31),差异有统计学意义(t=11.76,P<0.001)。ACYP1高表达组肝癌患者生存期短于低表达组,ACYP1高表达是肝癌患者预后差的独立危险因素(HR=2.402,95%CI:1.483~3.891,P<0.05)。根据ACYP1表达水平诊断肝癌的曲线下面积为0.965。ACYP1表达水平还与免疫细胞浸润和免疫检查点程序性细胞死亡蛋白1(r=0.288,P<0.001)及细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(r=0.311,P<0.001)呈正相关。结论ACYP1是肝癌诊断和预后的潜在生物标志物,也是治疗的潜在靶点。