重组肝刺激因子对肝脏卵圆细胞增殖的作用

目的 观察重组人肝刺激因子 (hHSS)对肝脏卵圆细胞增殖的影响。 方法 分离大鼠肝卵圆细胞 ,加以培养 ,并进行细胞学鉴定。将重组的hHSS作用于肝脏卵圆细胞 ,以MTT法、流式细胞术观察其对卵圆细胞的增殖作用。 结果 实验分离的卵圆细胞同时表达肝细胞和胆管细胞特异性标志物。给予重组hHSS作用 1 2～2 4h后 ,细胞增殖速度减缓 ,细胞DNA合成减弱 ,其作用的最有效浓度为 2 4 0mg L。 结论 重组hHSS能抑制卵圆细胞的增殖。

大鼠肝脏前体细胞——小圆细胞的分离与特性的初步研究

通过与大鼠肝卵圆细胞的对比,对肝脏中一种新的前体细胞——小圆细胞进行分离和初步特性分析。以分步消化法制备小圆细胞,MTT法观察其增殖特点,以白蛋白、细胞角蛋白19、甲胎蛋白为标志物,应用免疫细胞化学染色的方法,对其进行鉴定。同时用DMSO刺激小圆细胞分化,检测分化结果,并与卵圆细胞加以比较。结果显示,小圆细胞增殖不明显。小圆细胞与卵圆细胞均表达白蛋白和角蛋白19。DMSO刺激后小圆细胞向卵圆细胞分化,分化前细胞AFP呈阳性,分化后细胞形状、标志物表达与卵圆细胞一致。本实验提示,小圆细胞很可能是早于卵圆细胞的一种肝脏前体细胞。

肝脏干细胞

近年来动物实验的结果已经证明肝脏确实存在干细胞.大多数肝损伤情况下是由肝细胞分裂、增殖来完成肝脏再生.

16层螺旋CT颈部血管成像的初步临床应用

目的:探讨颈部血管(颈动脉、椎动脉)16层螺旋CT血管造影成像技术及其临床应用价值。材料和方法:38例临床怀疑颈动脉及椎动脉狭窄者,经16层螺旋CT扫描后,用薄层横断面放大图像(MTI)及最大密度投影(MIP)、多平面重建(MPR)、曲面重建(CPR)等后处理方法,进行管腔及管壁斑块的形态学显示,并用高级血管分析软件测量狭窄段径线、狭窄段长度等作定量分析。结果:38例共计76支颈动脉、76支椎动脉CTA图像中,正常颈动脉血管40支,狭窄血管36支,其中1支颈总动脉中度狭窄者合并有动脉瘤;76支椎动脉中,6支椎动脉狭窄,受压于邻近椎体骨质;38例中有9例行颈动脉DSA检查,18例做了颈动脉多普勒超声(TCD),7例DSA和16例TCD对照结果一致,2例CTA轻度狭窄者TCD显示正常,11例颈动脉斑块均为混合密度斑块。结论:16层螺旋CT颈部血管成像图像质量满意,重建图像质量高,能较准确显示管腔狭窄及管壁斑块形态学改变,满足临床诊断需要,具有很好的临床筛查及实用价值。

丁酸钠对肝卵圆细胞甲胎蛋白表达的影响

目的 探讨 0 75mM丁酸钠对肝卵圆细胞甲胎蛋白 (AFP)表达和向细胞外分泌AFP的影响。方法从喂饲含 0 1%乙硫氨酸的胆碱缺乏性饮食 4～ 6周的大鼠肝脏中分离出肝卵圆细胞。噻唑蓝 (MTT)比色法做生长曲线 ,观察 0 75mM丁酸钠对肝卵圆细胞生长的影响。收集 0 75mM丁酸钠处理 4天后的肝卵圆细胞及其培养上清液。将细胞裂解后 ,用WesternBlot检测胞内AFP的表达水平。用酶联免疫吸附法 (ELISA)测定培养上清液中的AFP浓度。结果 生长曲线的结果显示 0 75mM丁酸钠对肝卵圆细胞的生长有一定的抑制作用。WesternBlot的结果提示0 75mM丁酸钠能显著降低肝卵圆细胞AFP的表达水平 (P <0 0 5 ) ,但ELISA法测定的培养上清液中AFP的含量却没有显著改变。结论 0 75mM丁酸钠对肝卵圆细胞的生长有一定的抑制作用 ,并能降低肝卵圆细胞AFP的表达水平。

黄芪刺激体外培养的大鼠肝卵圆细胞生长的作用

目的探讨黄芪对体外培养的大鼠肝卵圆细胞生长的影响。方法从喂饲含0．1%乙硫氨酸的胆碱缺乏性饮食4～6周的大鼠肝脏中分离出肝卵圆细胞,用RT-PCR、免疫组化、Westem blot等方法对培养的细胞进行鉴定。MIT法观察不同浓度黄芪对肝卵圆细胞生长的影响；Giemsa染色法观察细胞表型的改变情况；碘化丙啶染色流式细胞仪测定细胞周期的变化。结果所分出的细胞既表达干细胞标志物c-kit,也表达胚胎肝细胞标志物甲胎蛋白、胆管细胞标志物OV6和CK19,此外还表达成熟肝细胞标志物白蛋白,认为它们是大鼠肝卵圆细胞。从0．125mg/ml～4mg/ml黄芪处理肝卵圆细胞48h后都有促进其生长的作用,其中2mg/ml黄芪刺激生长作用最明显(P＜0．05)。2 mg/ml黄芪处理肝卵圆细胞48h后既出现了一些增殖能力强的细胞,也出现了一些核质比低的细胞,此时细胞周期测定结果显示处G_2-S和M期的细胞比未用黄芪处理的对照细胞增多。结论黄芪具有明显的刺激体外培养的肝卵圆细胞生长的作用。

腺相关病毒Rep78蛋白对乙型肝炎病毒C基因的抑制作用

目的 研究腺相关病毒(AAV)Rep78蛋白对乙型肝炎病毒C基因(HBV-C)的抑制作用及机制。 方法 以pEOB6(含有HBV全长的质粒)为模板,聚合酶链反应法分别扩增出HBV-C启动子基因及含有HBV-C启动子的HBV-C基因。利用pMAL-Rep78体外扩增得到Rep78蛋白。以凝胶电泳阻滞实验检测Rep78与HBV-C启动子的结合,体外转录实验观察Rep78对HBV-C转录的影响。 结果 聚合酶链反应法扩增出了的HBV-C启动子基因(182 bp)及含有HBV-C启动子的HBV-C基因(789 bp)。凝胶电泳阻滞实验结果显示Rep 78与HBV-C启动子结合,呈剂量依赖性并可以被Rep 78抗体阻滞。体外转录实验显示Rep78明显抑制HBV-C的转录。 结论 AAVRep78可以通过与HBV-C启动子结合抑制HBV-C的转录。

丁酸钠诱导体外培养的大鼠肝卵圆细胞分化为成熟肝细胞

目的 探讨分化刺激剂丁酸钠对体外培养的大鼠肝卵圆细胞分化的影响。 方法 从喂养含0.1％乙硫氨酸的胆碱缺乏性饮食4-6周的大鼠肝脏中分离出肝卵圆细胞,用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法对其进行鉴定。用0.7 5 mmol/L丁酸钠处理大鼠肝卵圆细胞后,姬姆萨染色观察细胞表型改变,western blot检测细胞白蛋白的表达水平。 结果 免疫细胞化学结果显示分离出的细胞既表达成熟肝细胞的标志物白蛋白,也表达胆管细胞的标志物细胞角蛋白19,RT-PCR结果显示这些细胞还表达干细胞的标志物c-kit,但不表达造血干细胞的标志物CD3(?),表明这些细胞是大鼠肝前体细胞--肝卵圆细胞。0.7 5 mmol/L丁酸钠能诱导大鼠肝卵圆细胞出现明显的表型改变,细胞变大、变圆,核浆比减小,且双核细胞数增多,约占总细胞数的50％左右,同时western blot的结果显示0.75 mmol/L丁酸钠能够提高大鼠肝卵圆细胞白蛋白的表达水平。 结论 分化刺激剂丁酸钠能诱导体外培养的大鼠肝卵圆细胞向成熟肝细胞分化。

荧光定量聚合酶链反应检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1方法的建立

目的构建含有金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TIMP-1的标准曲线,为荧光定量PCR准确检测TIMP-1奠定基础.方法提取大鼠星状细胞系HSC-T6的mRNA,经RT-PCR扩增TIMP-1基因后与pGMT-Vector 连接,转化到大肠杆菌DH5α,以筛选得到的阳性克隆质粒作为标准品进行梯度稀释,分别用Taqman荧光探针技术和SYBR Green I荧光染料技术进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对两者结果进行了对比.同时进行普通PCR检测,与荧光定量PCR方法检测结果进行比较.结果重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pGMT-TIMP-1基因已成功克隆.以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增, 应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线的线性检测范围为7×104～7×108拷贝,检测灵敏度为7×104拷贝;应用SYBR Green I荧光染料技术的线性检测范围为7×106～7×108拷贝,检测灵敏度为7×106拷贝,且熔解曲线显示出现非特异性扩增;两种技术相对于普通PCR技术均具有定量功能.结论所构建的pGMT-TIMP-1基因荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好, 灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量PCR检测TIMP-1基因的标准方法.

含乙型肝炎病毒C基因的重组腺相关病毒对树突状细胞的作用

目的 研究腺相关病毒(AAV)为载体的含有乙型肝炎病毒(HBV)C基因重组病毒(rAAV-HBV-C)感染树突状细胞(DC)的效率及对DC生长和成熟的影响。 方法 从正常人外周血中分离单个核细胞收取单核细胞进行体外培养,分别用rAAV-HBV-C和293细胞裂解物感染刺激单核细胞,感染后的单核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF α)存在的条件下继续培养获得成熟的DC。用逆转录聚合酶链反应及流式细胞仪细胞内染色检测目的基因(HBV-C)的转录及表达;通过观察不同时间DC的形态及检测收获DC时其表面分化抗原(CD)的表达来评价DC的生长和成熟状态。 结果 rAAV-HBV-c感染后的DC可转录HBV-C基因并表达HBV-C抗原,病毒感染组与对照组收获的DC在细胞形态与CD表达方面差异无统计学意义。 结论 rAAV-HBV-C可有效感染DC,感染的病毒对DC的生长及成熟没有显著影响。

经颅视神经松解术治疗视神经管相关区骨折所致视神经损伤

北京同仁医院神经外科开展视神经管骨折导致的视神经损伤的手术治疗，在实践中发现部分病例没有视神经管骨折，但是存在眼眶眶尖区，蝶骨平台骨折，伴蝶窦外侧壁，蝶骨小翼的骨折，通过治疗，视力恢复较视神经管骨折导致的视神经损伤的患者好，将此类病例称为视神经管相关区骨折所致视神经损伤，手术治疗称为经颅视神经松解术。

带有HBV基因的腺相关病毒为载体的重组病毒感染树突状细胞的研究

目的探讨腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）为载体的含有HBV—S、C或X基因的重组病毒（rAAV—HBV—S，C，X）感染正常人树突状细胞的效率。方法分别构建含有HBV-S、C和x基因的从v质粒，在293细胞中包装成重组病毒，测定病毒滴度。从正常人外周血中分离出单核细胞进行体外培养，在培养的第1天分别用rAAV—HBV—S、C、X和作为对照的293细胞裂解液感染刺激单核细胞，感染后的单核细胞在GM-CSF、IL-4和TNF-α作用下继续培养7d获得成熟的树突状细胞。用RT-PCR及流式细胞仪细胞内染色检测HBV基因的RNA和蛋白的表达。结果重组rAAV—HBV—S、C、X的病毒滴度可以达到10^7拷贝／ml，用重组病毒分别感染树突状细胞。与对照组相比，感染的树突状细胞可表达相应的HBV基因RNA，流式细胞仪检测显示约90％的树突状细胞有相应HBV蛋白的表达。结论rAAV-HBV可有效感染树突状细胞，提示可以通过该途径刺激树突状细胞提呈抗原。