1株与大肠埃希菌O157生化结果相似的志贺氏菌的鉴定

目的对一菌株sznjO23进行分析鉴定。方法从猪肝中分离到菌株sznjO23,并对该菌株的菌落形态、生化特征及分子生物学特性进行分析。结果该菌株在CT-SMAC平板上呈圆形、光滑、较小的无色菌落,在改良CHROMagarO157显色平板上为紫色圆形的菌落。经全自动微生物鉴定分析系统VITEK 2 Compact鉴定,其生化结果96%可能性为大肠埃希菌O157,但血清学试验结果反应完全混浊,未出现任何凝集。16SrDNA序列分析发现,该菌株与志贺氏菌(ATCC29903)的进化距离较近、同源性高,相似度为99.26%。结论菌株sznjO23为志贺氏菌。当生化试验、血清学试验结果不一致时可选择16SrDNA序列分析的方法进行鉴定,以保证结果的准确性。

副溶血性弧菌K抗原检测实验条件优化

目的优化副溶血性弧菌K抗原检测的实验条件。方法通过调整菌悬液的浓度、选择基础实验材料和控制反应的温度3个方面的因素,对已知血清型的副溶血性弧菌进行血清学实验。结果当反应温度为37℃时,以90 mm无菌培养皿为基础耗材、20 mg/300μL浓度的菌悬液更容易快捷地观察到凝集现象,并且凝集颗粒较多,较大。结论基于本研究优化后的实验条件,使得凝集结果判读更加容易,实验操作更为简便、安全,且提高了血清学实验的效率。

深圳市畜禽产品中沙门氏菌血清型与耐药性研究

目的了解深圳市畜禽产品检出的沙门氏菌的血清型与耐药性。方法选取2013~2015年分离出的70株沙门氏菌,进行血清型鉴定和药物敏感性试验。结果共确定了18个血清型,以伦敦沙门氏菌检出数量最多。药敏试验结果显示,70株沙门氏菌有24种多重耐药谱,全部菌株对头孢唑啉、阿米卡星和庆大霉素耐药,对厄他培南、亚胺培南和美洛培南敏感。耐药5种及5种以上菌株在猪肉中占78.0%,数量最多。结论建立食源性沙门氏菌耐药性的长期监测机制,对该病原菌的防控及指导养殖业和临床合理用药具有现实和医学意义。

非洲猪瘟病毒的快速检测方法研究进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种高度接触性传染病,对养猪业危害严重。世界动物卫生组织将其列为法定呈报的动物疫病,我国将其列为一类动物传染病。由于此病目前无有效疫苗进行预防,为防止疫病的传播,可靠、快速的早期诊断对于实施严格的卫生和生物安全措施必不可少。本文就非洲猪瘟的病原学检测和血清学抗体检测技术及其应用进行了综述,以期为非洲猪瘟的快速诊断提供技术参考。

冰鲜金鲳鱼样品中一株副溶血性弧菌的分离与鉴定

目的对一株分离于冰鲜金鲳鱼样品中的菌株进行分析鉴定。方法利用TCBS培养基和弧菌选择性培养基从冰鲜金鲳鱼样品中分离到1株菌株sznj V083,并对该菌株的菌落形态、生理生化特征及其分子生物学特性进行分析。同时进行副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)标准菌株ATCC33847,创伤弧菌(Vibrio vulnificus)标准菌株ATCC27562的质控检验。结果该菌株在TCBS平板上呈现蓝绿色菌落,而在弧菌显色平板上呈现深蓝色菌落,其全自动生化鉴定结果显示其为创伤弧菌。PCR试验和16S rDNA序列分析表明,该菌株为副溶血性弧菌并与参考菌株Vibrio parahaemolyticus BB22OP(登陆号CP003973.1)的同源性最高。且该菌株的毒力基因tdh、trh检测为阴性。结论分离于冰鲜金鲳鱼样品中的菌株sznj V083为副溶血性弧菌。在副溶血性弧菌的检测中,除了常规的生理生化等方法外,还应该结合16S rDNA基因序列分析或PCR方法提高检测结果的特异性和灵敏度,以保证检测结果的真实性和准确性。

高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫幼虫的初步研究

目的 利用实时荧光PCR及高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫Ⅲ期幼虫。 方法 针对广州管圆线虫核糖体RNA基因的内转录间隔区（ITS）序列设计引物，应用实时荧光PCR和高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫Ⅲ期幼虫。并通过检测广州管圆线虫、华支睾吸虫和棘颚口线虫DNA，分析该方法的特异性；分别检测1~10条广州管圆线虫Ⅲ期幼虫DNA，分析该方法的敏感性。 结果 该方法能够特异性检测广州管圆线虫幼虫，检测华支睾吸虫和棘颚口线虫时未出现扩增曲线和熔解曲线峰。检测灵敏度可达到1条幼虫。 结论 实时荧光PCR及高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫幼虫具有较好的特异性和敏感性。

副溶血性弧菌与弧菌科易混淆菌的鉴别方法

目的快速鉴别副溶血性弧菌检测工作中常见的几种易混淆菌。方法首先筛选出7株在副溶血性弧菌检测工作中的易混淆菌株,分别通过选择性平板、初步生化筛选和干制生化鉴定试剂盒的方法,对包括副溶血性弧菌标准菌株在内的8株菌进行鉴别分析。结果各菌株培养24h后,只有创伤弧菌能在改良纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E琼脂平板上生长;硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基对弧菌科菌株鉴别性较强;结合硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基以及弧显平板上的菌落大小和颜色特征,可对以上8株菌进行鉴别,利用各菌株在副溶血性弧菌的典型生化反应上的不同点,可进一步进行验证。结论掌握各检测阶段菌株的不同特征,通过常规检测方法实现快速鉴别,节省检测时间,提高检测效率,及时发现其它可疑致病菌。

海水鱼中异尖线虫的虫体分离方法优化

目的对海水鱼中异尖线虫虫体分离方法进行优化。方法以市售海水鱼为本研究对象,在实验室条件下解剖鱼体,通过用生理盐水漂洗和标准筛过滤的方法,分离海鱼体内异尖线虫。结果优化后的方法能较为快速的获取虫体,无杂质干扰,便于后续镜下观察。结论本方法快速、便捷,可适用于海水鱼中线虫的快速取样。

表达鸡新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因的重组腺病毒对肝癌细胞HepG-2的抑制作用

目的探讨表达鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的重组腺病毒Ad-HN对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法应用Ad-HN感染HepG-2细胞,采用MTT法检测Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制作用;AnnexinV染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;AO/EB染色法和DAPI染色法对Ad-HN感染的肿瘤细胞及细胞核进行形态学观察;底物显色法检测Caspase1、Caspase3、Caspase6和Caspase8活性的变化。结果Ad-HN能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,当感染剂量为100MOI,作用时间为48h时,Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制率达峰值(17.20%～35.04%);AnnexinV染色结果显示,Ad-HN感染48h后HepG-2细胞凋亡率为29.39%;Ad-HN感染导致HepG-2细胞呈现细胞浓缩、细胞核皱缩进而碎裂等凋亡特征;Ad-HN感染可显著上调HepG-2细胞的Caspase酶活性。结论Ad-HN能够诱导HepG-2细胞凋亡,并对HepG-2细胞产生抑制效应。

缺失E3L基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选

通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子(pE/L)、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp(Locus of X-over P1)序列的表达盒构建穿梭质粒pTE-EGFP。利用pTE-EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E3L基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE--EGFP+。利用rTTVV-TE--EGFP+和含有Cre(Cyclization recombination)重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--,并利用聚合酶链式反应(PCR)对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE--中无E3L基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。

检测猪粪便中基因4型戊型肝炎病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的建立

针对基因4型戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因组ORF3设计特异性引物和探针,建立了一套TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。评价了该方法的准确性和灵敏性,同时与常规RT-PCR和巢式RT-PCR方法进行了对比分析。结果表明,生成的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.994,斜率为-3.312,PCR效率为100%。组内和组间重复性试验相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著,并且能够准确的从HEV阳性猪粪便样品中检测到基因4型HEV RNA,具有较好准确性。可检测到戊型肝炎病毒数量为(1.7×101)copies,比普通RT-PCR的灵敏度高100倍,比Nested RT-PCR高10倍。

表达Apoptin基因抗肿瘤双特异性重组腺病毒的构建及鉴定

为研发一种安全、特异、高效的抗肿瘤基因治疗候选药物,本试验基于人端粒酶启动子(hTERTp)、人5型腺病毒复制必需基因(E1a)和特异性抑癌基因(Apoption),利用RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统,构建了一种具有肿瘤特异性杀伤和特异性复制能力的双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad-VT。并利用人肝癌细胞(HepG-2)、人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、人胚胎肺细胞(WI-38)和非洲绿猿肾细胞(Vero)对hTERTp的肿瘤特异性进行鉴定。结果显示,hTERTp可在HepG-2、A549和Hela等肿瘤细胞内特异性启动外源基因的表达,而在WI-38、Vero等正常细胞内不能启动相关基因表达。用RT-PCR及Western-blot等方法对Apoptin基因和E1a基因的转录和表达进行了鉴定。结果表明,Ad-VT能够有效表达Apoptin和E1a等外源基因。

缺失TA35R基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选

通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。

缺失TC7L-TK2L基因减毒天坛株痘苗病毒构建及筛选

目的通过敲除天坛株痘苗病毒(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)的复制非必需基因TC7L-TK2L,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术构建TC7L-TK2L基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TC7L--TK2L-。方法人工合成含有痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的重组臂,构建穿梭质粒pTC7L-TK2L-EGFP,再与VTT共转染BHK-21细胞,通过连续筛选10次,获得含有筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L--EGFP+;利用Cre/loxp系统敲除EGFP,连续筛选10次,获得无筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,用PCR方法对rVTT-TC7L--TK2L-进行鉴定和遗传稳定性检测,用电镜观察病毒形态变化,并通过绘制生长曲线观察病毒在细胞内的复制情况。结果 PCR结果表明,成功构建了重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,且具有良好的遗传稳定性;电镜观察痘苗病毒缺失TC7L-TK2L基因未影响病毒形态;生长曲线显示敲除TC7L-TK2L基因后病毒毒力显著下降,但不影响病毒的正常复制。结论成功构建了痘苗病毒减毒株rVTT-TC7L--TK2L-,该重组痘苗具有良好的遗传稳定性且毒力减弱。

双重实时荧光聚合酶链式反应检测棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭

目的建立检测棘鳞蛇鲭(Ruvettus pretiosus, RP)和异鳞蛇鲭(Lepidocybium flavobrunneum, LF)两种油鱼的双重实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法。方法基于棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因分别设计特异性引物和探针,并对方法进行灵敏度、特异性和重复性分析,建立双重实时荧光PCR方法。结果模板量在8.4×10^5~8.4×10^0 copies/μl范围内,方法具有良好的线性关系,棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭的线性回归方程分别为y=-3.18x+41.0(R^2=0.998 8)和y=-3.37x+44.5(R^2=0.998 6),方法组内相对标准偏差(RSD)为0.29%~0.84%。其中,检测棘鳞蛇鲭的组内RSD为0.29%~0.84%,检测异鳞蛇鲭的组内RSD为0.29%~0.62%。方法最低检测限为16.8 copies/反应,并且从随机购买的50份鳕鱼样品中鉴定出油鱼成分棘鳞蛇鲭。结论本试验建立的双重实时荧光PCR方法能够特异性地鉴定出棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭,具有实际应用潜力。

几株来自水产品的粪肠球菌生化特性探讨

目的在金黄色葡萄球菌检测过程中快速鉴别粪肠球菌,掌握粪肠球菌生化特性。方法将水产品检测工作中分离出的3株粪肠球菌及标准菌株、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌,按照GB 4789.10—2016方法,分别通过增菌、选择性平板分离、初步鉴定及全自动生化鉴定系统补充鉴定等方法,对6株菌的菌落生长特征、生化特征进行鉴别分析。结果粪肠球菌基本符合GB 4789.10—2016方法中对金黄色葡萄球菌典型特征的描述,但粪肠球菌在48 h培养的B-P平板上菌落周围未见沉淀圈,金黄色葡萄球菌可见沉淀圈。粪肠球菌与金黄色葡萄球菌均可使兔血浆凝固,但凝固时间不同。结论粪肠球菌是水产品金黄色葡萄球菌检测工作中易混淆菌株,掌握其在各检测阶段与金黄色葡萄球菌的区别特征有利于快速鉴别,节省检测时间,提高检测效率。