基于PEDV ORF3基因的强弱毒株鉴别方法的建立及初步应用

为了建立一种快速鉴别PEDV强毒株和弱毒株的RT-PCR方法,针对PEDV ORF3基因设计一对引物,优化其反应体系和退火温度,并测试其特异性和敏感性。结果显示,在退火温度55.2℃,上、下游引物各0.5μL时PCR扩增效果最理想。特异性试验结果显示本方法对9种常见猪病病原的核酸模板均不产生扩增条带;敏感性试验显示该方法的检测下限为T-ORF3_(IS) 272拷贝/μL和T-ORF3_(VC) 14.4拷贝/μL。将本试验建立的RT-PCR法与已建立的双重RT-PCR方法进行比较,结果显示两种方法符合率为99.2%,且本法的实际检出率更高。对120份临床样本检测结果显示,PEDV强弱毒株的阳性率分别为87.18%和84.21%,其中9份样本中同时检出2种PEDV毒株,但并未对检测方法的准确性造成影响。建立了一种基于ORF3基因的RT-PCR检测法,该方法特异性强、灵敏度高,可准确区分PEDV野毒株和弱毒株。

猪A群轮状病毒RVA/Pig-tc/CHN/SWU-1C/2018/G9P[13]株的分离与鉴定

为分离并鉴定A群猪轮状病毒(PoRV),本研究通过MA-104细胞分离培养、间接免疫荧光鉴定、RT-PCR鉴定以及序列分析对一份疑似Po RV感染的小肠样本进行了病毒的分离与鉴定。结果显示,分离到一株Po RV,其基因型为G9-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-NI-T7-E1-H1,命名为RVA/Pig-tc/CHN/SWU-1C/2018/G9P[13]。经序列分析显示,该病毒的VP7、VP4、VP6、NSP1、NSP2、NSP4和NSP5基因与Po RV相似性最高,达92.9%~98.3%,而VP1~VP3、NSP3基因与人源A群轮状病毒(GAR)相似性最高,达94.1%~97.3%,表明该病毒为一株人猪重配的Po RV。经软件重组分析显示,该病毒的VP2基因在626 bp处与人源GAR R1207株发生重组,进一步证实该病毒为人猪重组病毒株。本研究首次在中国大陆报道分离鉴定到一株猪源人猪重配的G9P[13]型Po RV,为后续对其致病性研究奠定了基础。

2017-2019年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查

【目的】通过对四川地区规模化猪场A群轮状病毒(RVA)的分子检测,从而了解RVA流行情况及分子特征,为猪RVA疫苗研制提供理论基础。【方法】2017—2019年从四川省14个地区40个猪场采集303份仔猪腹泻样本,用荧光定量RT-PCR方法调查RVA的分子流行率,用RT-PCR方法对RVA阳性样本进行分型和VP4和VP7全基因组的扩增,用Rota C2.0软件确定相应毒株的基因型,用MegAlign软件进行同源性分析,通过MEGA 7.0软件用邻近法构建系统进化树,用SimPlot和RDP4软件进行重组分析。【结果】303份仔猪腹泻样本检出RVA阳性样本98份,阳性率为32.34%(98/303,95%CI=27.1%—37.9%)。从98份RVA阳性样本中扩增出39个VP7片段,G9为优势基因型(41%),G4、G5、G26和G3各占23%、28.2%、5.1%和2.7%。扩增出的59个P型中以P[13]型为主,占40.7%,其次为P[6]、P[23]和P[1]型,分别占30.5%、23.7%和5.1%。30株毒株成功鉴定出G/P基因型,G9P[23](23.3%)为优势组合基因型。其他基因型为G4P[6](16.7%)、G9P[13](13.3%)、G5P[23](10%)、G5P[13](10%)、G9P[6](6.7%)、G26P[13](6.7%)、G4P[13](6.7%)、G4P[23](3.3%)和G3P[13](3.3%)。基因型G5P[23]、G4P[13]、G9P[6]、G26P[13]和G4P[23]为国内首次鉴定。此外,重组分析表明4株毒株在VP7或VP4基因上存在重组现象。【结论】四川地区腹泻仔猪粪便中RVA的流行率高且基因型复杂,优势组合基因型为G9P[23]。该结果丰富了四川地区RVA的流行病学资料,对四川地区猪RVA的防控提供了重要参考。