重症肌无力患者胸腺提取液电泳及其活性分析

目的 :深入探讨胸腺在重症肌无力 (MG)发病中的作用。方法 :采用SDS PAGE电泳对MG患者胸腺提取液进行分析 ,并用MTT法研究了胸腺提取液对外周血单个核细胞和胸腺细胞增殖的影响。结果 :30 %MG患者胸腺提取液中存在异常蛋白 ,其相对分子质量小于 144 0 0 ,而在先天性心脏病患者胸腺细胞培养上清中未见这种蛋白。异常蛋白组MG患者的胸腺提取液对正常人外周血单个核细胞 (PBMC)增殖有显著的抑制作用 ,与非自身免疫病患者相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,与其他非异常蛋白组MG患者相比差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,但对胸腺细胞的增殖未见显著差异。结论 :MG患者免疫功能的异常与胸腺提取液中小分子异常蛋白的存在有关 ,与MG的发病有关。

某市A、B 2水厂水样的致突变性检测

1991年9～10月取某市2家水厂的水原水和出厂水各4个样品，经XAD-Ⅱ树脂富集有机物，用Ames试验检测其致突变性，检测结果表明：2家水厂的水源水已有致突变物污染，突变菌落大多为对照之数倍，最高为10余倍，有剂量反应关系，出厂水的致突变性更强，2家水厂水源水和出厂水的致突变物主要为移码突变型，同时存在置换突变型。

共凝试验快速检测淋球菌

共凝试验快速检测淋球菌阮丽荣，李智勤，冯羡菊（河南医科大学微生物与免疫学教研室郑州４５００５２）关键词共凝试验，淋球菌，检测目前淋病诊断主要根据病史，革兰染色和细菌培养来确诊。但上述方法漏诊率高，给临床诊断带来一定困难，作者应用共凝试验检测淋病奈瑟菌...

人胚脑源性神经干细胞特性及免疫原性研究

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞特性及免疫原性,为神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)移植治疗神经系统损伤奠定基础。方法:取孕14周流产胚胎,无菌分离制备大脑神经细胞悬液,用CD133标记的免疫磁珠分选NSC,提取NSCRNA,进行RT-PCR探测MHC-I,MHC-II类分子mRNA转录;用流式细胞术检测细胞表面MHC-I,MHC-II类分子的表达;用正常成人外周血单个核细胞与培养NSC共培养和MTT比色分析法观察淋巴细胞增殖反应;将NSC小鼠脑内接种,进行组织染色观察细胞移植部位的组织学变化。结果:新分离和传代的NSC均发生MHC-I,MHC-II类分子mRNA转录,MHC-I类分子在NSC表面的表达百分率为(5.66±0.37)%,NSC在体外能诱发淋巴细胞增殖反应,A值为1.09±0.48和1.15±0.29,与阴性对照比差异有显著性意义(P<0.05)。NSC小鼠脑内移植具有修复神经损伤作用,局部无淋巴细胞浸润和炎症。结论:人胚脑源性神经干细胞具有免疫原性,但直接脑内接种未发现引起明显的移植排斥反应。

重症肌无力患者胸腺细胞凋亡障碍与Fas表达异常的关系

目的 :探讨重症肌无力 (MG)胸腺细胞凋亡异常、Fas表达异常在自身免疫应答形成中的作用。方法 :用手术切除的MG患者的胸腺 ,制备胸腺提取液和胸腺细胞悬液 ,用MTT比色法测定胸腺细胞的增殖 ;用DNA电泳及细胞形态学观察细胞凋亡 ;用流式细胞仪检测细胞表面Fas的表达 ,用RT PCR结合单链多态构象性分析 (SSCP) ,探讨Fas基因的转录及可能存在的Fas基因突变。结果 :MG患者的胸腺提取液 ,能抑制正常胸腺细胞增殖 ,但不能抑制MG患者胸腺细胞增殖。在地塞米松作用下 ,正常人及患者胸腺细胞的增殖均可被抑制 ,细胞增殖抑制率分别为 5 8.33%和 5 4 .2 6 %。MG患者胸腺细胞的DNA电泳可见梯状条带 ,并且胸腺细胞上Fas的表达百分率增加 [(2 0 .38± 6 .0 7) % ],与空白对照组 [(12 .4 3±4 .32 ) % ]相比较P <0 .0 5。对MG患者胸腺细胞FasmRNA进行RT PCR SSCP分析 ,部分MG患者出现异常电泳条带。结论 :MG患者胸腺细胞的凋亡及Fas分子表达均异常 ,而且存在Fas基因突变 ,提示与本病的发生发展有关。

免疫磁珠法分离和纯化人胚胎神经干细胞

目的:建立有效的人类神经干细胞分离纯化系统和方法。方法:无菌取孕24周流产胎儿的室下区脑组织,制备细胞悬液,用磁性微珠标记的CD133单克隆抗体与细胞孵育,通过磁分选器分离出CD133(+)和CD133(-)细胞,通过体外培养并诱导分化,观察CD133阳性细胞和阴性细胞的增殖情况及分化能力。结果:经免疫磁珠分选的室下区脑组织中,CD133(+)细胞占胚胎脑组织细胞的2％左右,该细胞体外扩增能力强,细胞呈球形生长,并易聚集成团,培养5 d、10 d、15 d、20 d进行活细胞计数,细胞增长率分别为1.79％、4.82％、7.21％、14.66％,诱导分化后的细胞经染色鉴定可分化为神经元、神经胶质等多种神经细胞;阴性细胞扩增能力弱,活细胞计数以死细胞数量居多,大约70％,另外一些细胞贴壁分化。结论:免疫磁珠法简便、有效,经免疫磁珠分离的神经干细胞在体外能进一步培养扩增并分化。

GM-1对培养的人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:观察不同剂量神经节苷脂(GM-1)对神经干细胞增殖和分化的影响。方法:从人胚胎脑组织分离出神经干细胞,培养于含bFGF(阳性对照组)和B27(阴性对照组)的DMEM/F12细胞培养液中,实验组培养液中分别加入0.335μg/L,3.35μg/L及33.5μg/L的GM-1,用MTT比色分析法测定细胞增殖能力。用含体积分数3％血清的DMEM/F12培养液诱导细胞分化,每间隔6 h于倒置显微镜下观察细胞分化情况。结果:5 d、10 d MTT比色显示,GM-1(33.5μg/L)组与阳性对照组比较,P均>0.05,与阴性对照组比较,P均<0.05;GM-1(0.335μg/L)组、GM-1(3.35μg/L)组与阴性对照组比较,P均>0.05。分化实验发现,接种6 h后,体积分数3％血清+DMEM/F12组神经球周边可见明显的细胞突起,呈放射状向周围伸出,而3个实验组和阴性对照组的细胞突起短且细小,随着培养时间的延长,各组的细胞突起均逐渐伸长,3个实验组分化能力低于对照组,与阴性对照组之间无明显差异。结论:GM-1能够维持神经干细胞的原始神经状态,促进神经干细胞的增殖,对神经干细胞无明显的诱导分化作用。

人CD34^+脐血干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

目的探讨人脐血来源的CD34+干细胞治疗脊髓损伤的可行性,为脊髓功能障碍性疾病的临床治疗打下基础。方法用密度梯度离心及免疫磁珠法分离出人CD34+脐血干细胞,在含有B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人重组干细胞因子(rhSCF)的营养液中培养,用核荧光染色剂Hoechst33258标记细胞;制作大鼠脊髓横断模型,造成大鼠下肢瘫痪,在脊髓损伤3d移植荧光标记的CD34+脐血干细胞,观察移植后的动物行为变化、脊髓组织形态学变化等。结果脊髓损伤大鼠移植CD34+脐血干细胞5~6d可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,10~15d后可出现爬行,3~4周后后肢活动活跃;对照组瘫痪的肢体未见恢复。脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量神经胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性的细胞,移植区Hoechst33258荧光标记阳性细胞增生。结论移植的CD34+脐血干细胞可在移植部位增殖,并使脊髓横断大鼠运动功能恢复,有望成为治疗脊髓损伤的有效手段。

胶质瘤RNA致敏的人脐血树突状细胞诱导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的:制备人脐血来源的树突状细胞(DCs),用胶质瘤RNA诱导其成熟,并观察DCs诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性。方法:以rhGM CSF、IL4诱导人脐血单个核细胞向DCs分化并鉴定。提取胶质瘤RNA与DCs混合,使DCs致敏,未致敏的DCs为对照组。观察细胞形态并检测致敏前后DCs的表型。将DCs与外周血T细胞共培养,以胶质瘤细胞为靶细胞,采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性差异。结果:人脐血单个核细胞于诱导第5d呈现典型的DCs形态;经rhGM CSF、IL4诱导培养后,CD86、CD11c、CD54、MHCⅠ、MHCⅡ类分子表达与培养前比较均明显增高(P<0.01)。负载抗原后,MHCⅠ和CD54表达与负载抗原前相比进一步增高(P<0.05)。以DCs诱导活化的T细胞与胶质瘤细胞共培养可使胶质瘤细胞的生长受到抑制,并最终导致其死亡;杀伤率与未负载抗原的对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:人脐血单个核细胞在细胞因子的诱导下扩增并分化为DCs。经抗原致敏后,能增强淋巴细胞对相应肿瘤细胞的体外杀伤效应。

不同剂量神经节苷脂对神经干细胞增殖和分化的影响(英文)

背景:近年来研究表明神经节苷脂(gangliosides,GM-1)能够修复中枢神经系统中神经元的损伤。目的:观察不同剂量神经节苷脂(GM-1)对神经干细胞增殖和分化的影响。设计:完全随机对照的开放实验。地点与材料:研究地点为郑州市第二人民医院脑外科和郑州大学医学生物工程研究所。材料为胎龄10周流产胚胎脑组织。方法与主要观察指标:从人胚胎脑组织分离出神经干细胞,培养于含bFGF和B27的DMEM/F12细胞营养液中,实验组加入不同浓度的GM-1,用MTT比色分析法测定细胞增殖能力。用含3%血清的DMEM/F12营养液诱导细胞分化,每间隔6h于倒置相差显微镜下观察细胞分化情况。结果:5d,10dMTT比色显示:bFGF(20mg/L)+B27+DMEM/F12和GM-1(33.5mg/L)+B27+DMEM/F12两组间t检验,P值均>0.05;GM-1(33.5mg/L)+B27+DMEM/F12与B27+DMEM/F12两组间t检验,P值均<0.05;GM-1(0.335mg/L)+B27+DMEM/F12,GM-1(3.35mg/L)+B27+DMEM/F12与B27+DMEM/F12间t检验,P值均>0.05。分化实验发现,接种6h后,(3%)血清+DMEM/F12组神经球周边可见明显的细胞突起,呈放射状向周围伸出,而3个实验组和阴性对照组的细胞突起短且细小,随着培养时间的延长,各组的细胞突起均逐渐伸长,3个实验组分化能力低于对照组,与阴性对照组之间无明显差异。结论:GM-1能够维持神经干细?

人脐血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的从人脐血中分离单个核细胞(MNCs)、体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和定向诱导能力。方法无菌条件下采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养,分别向神经元样细胞诱导,获取MSCs,显微镜下观察它的形态、尼氏体染色;取扩增2、5、7代的MSCs,免疫细胞化学法检测nestin表达和神经元样细胞特异性标记。结果诱导扩增后的MSCs尼氏体染色阳性,第2、5、7代MSCs的nestin的阳性表达率分别为(51.2±3.2)%、(34.6±2.7)%、(11.3±3.3)%;神经元特异性烯醇化酶(NSE)在原代细胞无表达,而在2、5、7代MSC的阳性表达率分别为(11.4±2.3)%、(21.78±3.1)%、(40.7±3.4)%。结论人脐血MSCs具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。

人胚神经干细胞的冻存与复苏

目的:研究神经干细胞冻存复苏后的成活率及再培养生长情况。方法:利用无血清培养基短期体外培养胚胎来源的神经干细胞后,以冻存液(体积分数为70％ DMEM/F12,体积分数为20％胎牛血清,10％ DMSO)进行冻存,于1周、4周、8周、12周、16周、20周、24周分别复苏,计数活细胞比例并进行再培养。结果:复苏后神经干细胞的成活比例分别为68％、65％、65％、62％、61％、60％、60％,再培养生长良好。结论:本实验对神经干细胞成功地进行了冻存、复苏和再培养,对临床择期进行神经干细胞移植手术和建立“神经干细胞库”具有重要的意义。

重症肌无力患者外周血单个核细胞Fas及血清sFas、TNFα检测

目的:探讨外周血淋巴细胞凋亡与重症肌无力(MG)发生的关系。方法: 收集 20例MG患者及 20例健康献血者的外周血,分离单个核细胞和血清,用流式细胞仪测定单个核细胞膜Fas,用双抗体夹心ELISA法测定血清中sFas、TNFα水平。结果:MG患者血清sFas、TNFα水平较对照组高(P<0. 01);单个核细胞表面Fas分子的表达率低于对照组(P<0. 05)。结论:MG患者单个核细胞膜Fas分子和血清sFas、TNFα水平异常,可能与疾病的发生有关。

重症肌无力患者胸腺细胞基因突变的初步探讨

目的 探讨重症肌无力(MG)胸腺细胞异常增生的原因,揭示其发生机制。方法 利用患者手术摘除的胸腺组织,分离胸腺细胞,进行体外培养并用植物血凝素(PHA)或地塞米松、雌激素诱导48h,培养前后均从胸腺细胞提取RNA,反转录后,用三对引物分段扩增Fas cDNA,用银染法进行单链多态构象性分析(SSCP)。结果 正常人胸腺细胞诱导后均可见Fas mRNA表达,大约有25％的MG患者胸腺细胞体外诱导未见Fas mRNA表达,部分Fas mRNA表达与未诱导时电泳条带存在差异。结论 部分重症肌无力患者胸腺细胞Fas基因存在突变,这种突变可能是胸腺细胞异常增生的原因之一,与疾病的发生发展有关。

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。

不同脑区来源的成体大鼠神经干细胞体外增殖特性

目的:探讨成年大鼠神经干细胞的脑内分布及体外培养条件、增殖特性,为自体神经干细胞移植修复神经损伤提供理论依据。方法:分离成年大鼠纹状体、室区(VZ)和室下区(SVZ)的细胞,利用无血清培养技术培养并观察神经干细胞的生长规律,采用SABC法进行神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、增殖细胞核抗原(PCNA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸蛋白(GFAP)检测,并作姬姆萨染色,对细胞进行鉴定。结果:由成年大鼠纹状体、VZ和SVZ区获得的细胞群,均可在体外分裂增殖形成神经球,Nestin阳性,进一步分化后分别呈现NSE和GFAP阳性。结论:成年大鼠脑内特定区域具有存在神经干细胞。

重症肌无力患儿胸腺细胞体外增殖和CD4、CD8、Fas测定

目的:探讨胸腺异常在儿童重症肌无力(MG)患者发病中的作用.方法:取临床确诊MG患儿手术切除的及24～38周流产胚胎胸腺组织(对照),分离胸腺细胞,MTT比色分析法观察胸腺细胞体外增殖情况;用流式细胞仪测定胸腺细胞表面膜CD4、CD8和Fas.结果:与对照相比,MG患儿体外培养胸腺细胞增殖能力增强(P＜0.01),胸腺细胞CD4 CD8+细胞增多(P＜0.01),CD4+CD8+细胞减少(P＜0.01),CD4-CD8-、CD4+CD8-细胞数量无变化;CD4+Fas+、CD8+Fas+胸腺细胞均减少(P＜0.01).结论:MG患儿胸腺细胞存在增殖和膜分子表达的异常.

人外周血及脐血树突状细胞的体外诱导及抗肿瘤作用比较

目的:比较人外周血和脐血体外诱导扩增的树突状细胞在冻融抗原激活后的抗肿瘤作用。方法:分离正常人外周血或脐血单个核细胞,用重组粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)将其分别诱导为外周血树突状细胞(PbDC)及脐血树突状细胞(CbDC),2者分别于诱导前、诱导第7d及抗原刺激3d后用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的改变;分别将PbDC、CbDC与外周血T细胞共孵育,以K562为靶细胞,采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性的差异。结果:PbDC于诱导第7d、CbDC于诱导第5d呈现典型的DC形态。外周血和脐血单个核细胞经GM-CSF、IL-4诱导培养后,CD86、CD11c、CD54、MHC-I类分子表达均增高,脐血单个核细胞MHC-Ⅱ类分子表达增高,与培养前相比差异有统计学意义(P<0.01)。负载抗原后,MHC-I和CD54表达进一步增高,与负载抗原前比较差异有统计学意义(P<0.05)。分别以PbDC或CbDC诱导活化的T细胞为效应细胞,均可使肿瘤细胞的生长受到抑制,并最终导致其死亡,杀伤率与未负载抗原的对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Pb-DC组及CbDC组对肿瘤细胞均有杀伤活性,2组对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:经肿瘤抗原激活的外周血及脐血DC具有相似的抗肿瘤活性。

重症肌无力患者胸腺Fas基因突变及氨基酸变异分析

目的 :分析重症肌无力 (MG)患者胸腺Fas基因突变及其编码蛋白质的氨基酸变异 ,探讨Fas分子在重症肌无力发生中的作用。方法 :提取 8例MG患者胸腺总RNA ,经RT PCR法扩增出Fas基因全长 ,克隆后用荧光标记法进行基因测序 ,用DNASIS、OMIGA软件与Genbank中Fas序列进行同源性比较和分析。结果 :8例患者胸腺组织 6例出现Fas基因突变 ,突变率为 75 % (6 /8) ,其中 5例发生 2个以上位点突变 ,只有 1个位点突变的 1例 (1 2 .5 % ,1 /8) ;突变类型为 1 6 4位A→G ,相应的氨基酸变异为 5 5位Asp→Gly,96位His Arg,1 92位Arg→Lys和 2 5 1位Lys→Arg。Fas基因高度保守 ,患者之间同源性为 99.6 %～ 1 0 0 % ,Fas分子同源性为 98.7%～ 99.7%。结论 :重症肌无力患者胸腺组织中存在Fas基因突变和Fas分子结构变异 。