敲除Brg1基因对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞数量和功能的影响及其机制研究

目的研究染色质重构复合物核心催化亚基(Brahma-related gene 1,Brg1)对C57BL/6小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞数量和功能的影响及其可能的机制。方法取6~8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(Wild type,WT)及Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell Ⅱ,AECⅡs)上特异性敲除Brg1的C57BL/6小鼠(Brg1fl/fl)作为实验对象,每组选取8只小鼠,收取标本,利用免疫组化及免疫荧光分析肺组织中表面活性物质相关蛋白C(surfactant-associated protein C,SFTPC)阳性的细胞率,流式细胞术分析小鼠肺组织中表面活性物质蛋白C前体蛋白(prosurfactant protein C,pro SP-C)阳性的细胞(即AECⅡs)数量。Western blot检测各组小鼠肺组织中pro SP-C、SFTPC、表面活性物质相关蛋白A(surfactant-associated protein A,SFTPA)、表面活性物质相关蛋白D(surfactant-associated protein D,SFTPD)的表达水平。Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达及增殖相关信号转导途径中关键蛋白EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT及NF-κB p65的活化水平。结果抗SFTPC免疫组化、免疫荧光显示其在肺泡上皮表达较WT小鼠增多(P<0.05);流式细胞术显示Brg1fl/fl组小鼠肺组织中pro SP-C+的细胞百分比较WT小鼠明显增高(P<0.05),Western blot检测结果显示AECⅡs的功能性蛋白pro SP-C、SFTPC、SFTPA及SFTPD在Brg1^fl/fl小鼠中明显增多;Brg1^fl/fl组小鼠肺组织中NF-κB p65及周期蛋白CyclinD1的表达增加,且p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT百分比显著提高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论特异性敲除C57BL/6小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的Brg1可促使AECⅡs数量和分泌功能的增加,其可能机制与敲除Brg1促进EGFR/PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活,且与增殖周期蛋白CyclinD1表达的增加有关。

糖皮质激素调控Keap1-Nrf2通路减轻哮喘小鼠肺氧化应激反应的作用研究

目的探讨哮喘小鼠肺氧化应激水平以及地塞米松对其影响及可能的机制,为哮喘治疗提供新的方向。方法将30只6-8周龄C57BL/6雌鼠随机分为对照组、哮喘组及地塞米松组,利用屋尘螨(House dust mites,HDM)建立哮喘小鼠模型,检测哮喘激发后或地塞米松干预后,各组小鼠脂质过氧化物代谢产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、氧化型谷胱甘肽(Oxidized glutathione,GSSG)的表达水平。利用qPCR检测小鼠肺部氧化应激转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor2,Nrf2)和血红素加氧酶1(Heme oxygenase-1,HO-1)表达情况。免疫组化和免疫荧光检测小鼠肺部Nrf2蛋白表达水平。Western blot检测Nrf2-Keap1信号通路改变情况。结果哮喘组小鼠肺组织中MDA含量较对照组明显升高(P<0.01),地塞米松组MDA较哮喘组明显降低(P<0.05);哮喘小鼠的GSSG含量较对照组升高(P<0.01),地塞米松组小鼠GSSG含量较哮喘组降低(P<0.05)。qPCR结果显示哮喘组小鼠Nrf2和HO-1mRNA表达均较对照组明显增加(P<0.05),地塞米松组小鼠Nrf2和HO-1 mRNA表达较哮喘组降低(P<0.05)。免疫组化和免疫荧光检测结果显示哮喘组小鼠肺组织中Nrf2蛋白表达较对照组明显增加(P<0.01),地塞米松组小鼠肺组织Nrf2蛋白表达较哮喘明显减少(P<0.01)。Western blot结果显示地塞米松组肺组织Nrf2蛋白表达较哮喘组明显降低(P<0.05),Keap1蛋白表达较哮喘组明显增加(P<0.05)。结论哮喘小鼠中氧化应激水平增加,地塞米松可能通过调节Keap1-Nrf2通路,影响下游抗氧化反应元件的表达,从而抑制哮喘小鼠肺部氧化应激水平。

KIF3A通过结合Wnt/β-catenin通路中的β-arrestin参与哮喘气道上皮的炎症调控

目的研究KIF3A参与哮喘气道炎症调控的可能机制,为哮喘治疗提供新的靶点和方向。方法选取20只雌性6~8周龄C57BL/6小鼠建立哮喘模型,随机分为哮喘组与对照组(n=10)。Western blot和免疫组化(IHC)检测两组小鼠KIF3A的表达;在体外分别用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)和屋尘螨(house dust mite, HDM)干预人支气管上皮细胞16HBE,Western blot和RT-PCR检测KIF3A的表达;构建含有KIF3A的过表达组(LV-KIF3A-45894-J2,LV-KIF3A)和RNA干扰序列的慢病毒载体组(LV-KIF3A-RNAi-81183-1,RNAi),用含有空载的慢病毒和阴性对照序列的慢病毒载体作为对照,分别感染16HBE;免疫共沉淀检测过表达组中KIF3A与β-arrestin的结合,同时Western blot和RT-PCR检测各组细胞β-catenin的表达水平,RT-PCR检测KIF3A基因差异表达对趋化因子CCL-17和CCL-26表达的影响。结果哮喘组的KIF3A表达水平较对照组减少(P<0.05)。HDM干预16HBE后的KIF3A蛋白和mRNA表达水平较对照组有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。慢病毒载体感染16HBE 72 h且经流式分选绿色荧光阳性细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示LV-KIF3A组和RNAi组的KIF3A蛋白和mRNA表达分别增多(P<0.05)和下降(P<0.05)。免疫共沉淀证实KIF3A与β-arrestin相结合。LV-KIF3A组和RNAi组的β-catenin蛋白总量无明显差异;与对照组相比,RNAi组的β-catenin mRNA表达显著下降(P<0.000 1),LV-KIF3A组则无统计学差异。RT-PCR结果显示,与对照组相比,RNAi组的趋化因子CCL-17和CCL-26的mRNA水平增加(P<0.001),LV-KIF3A组则降低(P<0.05)。结论 KIF3A与Wnt/β-catenin通路中的β-arrestin结合,通过调节趋化因子CCL-17和CCL-26的表达而参与哮喘气道上皮炎症的调控。