P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达的调控

目的:研究P21对POLD1基因的调控通路,以探索阻断癌细胞恶性增殖的机制.方法:实验主要分3组:阴性对照组(转染空载体pXJ41-neo的803-pXJ细胞)、空白对照组(胃癌细胞MGC-803)、实验组(转染P21重组真核表达质粒pXJ41-p21的803-p21细胞).MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平的变化,Westernblot分析蛋白表达差异.结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞增殖受到明显抑制,凋亡率(%)增高(11.36±0.51vs7.39±0.17,7.69±0.47,F=85.338,均P<0.05).实验组P21mRNA表达水平显著提高(2.15±0.23vs1.05±0.11,1.00±0.00,F=59.054,均P<0.05),POLD1则显著下调(0.45±0.07vs1.09±0.13,1.00±0.00,F=49.907,均P<0.05);P21、P125蛋白表达变化与基因变化相一致.cyclinE、Rb1基因表达均上调,CDK2基因表达下调,c-myc基因表达则变化不大.结论:P21抑制了胃癌细胞的增殖、促进其凋亡,同时抑制了POLD1基因的表达,这种抑制作用可能通过CDK2、cyclinE、Rb1等细胞周期因子实现.

人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控

目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.

重组质粒BFP-cyclin D1的构建及表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力的影响

目的构建含人cyclin D1基因全长编码区的蓝色真核荧光表达载体BFP-cyclin D1,并观察cyclin D1的表达对MCF-7增殖和迁移能力的影响。方法以人乳腺癌MCF-7细胞总RNA为模板,经PCR扩增和酶切后与pEBFP-N1质粒连接,得到重组质粒BFP-cyclin D1。转染到人乳腺癌MCF-7细胞后分为3组:实验组转染BFP-cyclin D1,阴性对照组转染pEBFP-N1;空白对照组为MCF-7,以荧光定量PCR检测基因表达;MTT实验检测细胞生长速度;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功构建了BFP-cyclin D1,并在人乳腺癌MCF-7细胞中呈高表达,荧光定量PCR检测示实验组cyclin D1在转染后12h开始增高,48h达到高峰并持续高表达,与激光共聚焦显微镜观察实验组蓝色荧光表达量的趋势一致;MTT实验证实实验组细胞增殖速度(48、72、96h)显著高于对照组(P<0.01);细胞迁移实验表明实验组细胞迁移能力显著高于对照组细胞(P<0.01)。结论 cyclin D1的高表达促进了人乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移,这可能与其缩短细胞周期、促进DNA合成和复制功能有关。

三亚地区儿童社区获得性肺炎病原菌分布及耐药性分析

目的了解三亚地区儿童社区获得性肺炎病原菌分布情况及耐药特点,为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法回顾分析三亚地区2011年1月至2013年12月确诊的儿童社区获得性肺炎住院患儿阳性痰培养标本485例。结果 485株病原菌中,革兰阴性菌占65.36%,革兰阳性菌占29.28%,真菌占5.36%。排名前五位的细菌是肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌。革兰阴性菌对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、碳青霉烯类抗菌药物的耐药率均小于20.0%。未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的阳性球菌。结论三亚地区儿童社区获得性肺炎病原菌以革兰阴性菌为主,耐药现象与文献报道存在一定差异,因此临床医生应参照本地区流行病学特点合理使用抗菌药物,以控制细菌耐药率的上升。

结肠癌组织中CDC6的表达及临床意义

目的探讨结肠癌组织中CDC6的表达及其临床意义。方法采用免疫组化MaxVision法检测121例结肠癌及癌旁正常黏膜组织中CDC6的表达,分析CDC6与结肠癌临床病理特征及预后的关系。结果CDC6在93.39%(113/121)的结肠癌组织中呈细胞核和细胞质阳性,仅在5.79%(7/121)的癌旁正常黏膜组织中呈细胞核阳性,差异有统计学意义(P<0.01)。CDC6表达升高与肿瘤转移、TNM分期明显相关(P<0.05);与患者年龄、性别、肿瘤分级等无关(P>0.05)。CDC6高表达组结肠癌患者5年生存率为54.9%(28/51),而低表达组为81.82%(18/22),差异有统计学意义(P<0.05)。结论CDC6在结肠癌组织中表达增高与癌转移、TNM分期及患者生存期相关,其有望成为结肠癌预后的可靠指标。

p16、p125的表达及HPV分型检测在宫颈鳞状上皮内病变中的临床应用

目的研究不同级别宫颈病变中p16、p125蛋白的表达情况,并分析不同宫颈病变中HPV的分型结果,以探讨p16、p125联合HPV分型检测在宫颈病变诊断中的应用价值。方法选取我院2017-01—2018-12间不同宫颈病变231例,共分为4组,其中慢性宫颈炎28例、低级别鳞状上皮内病变60例、高级别鳞状上皮内病变88例、宫颈鳞状细胞癌55例,用免疫组织化学的方法检测p16、p125蛋白的表达情况,用PCR-反向点杂交方法进行HPV分型检测。结果 p16在慢性宫颈炎、低级别鳞状上皮内病变、高级别鳞状上皮内病变及宫颈癌4组宫颈病变中阳性率分别为3.6%、21.7%、80.7%、96.4%,p125在四组病变中的阳性率分别为10.7%、26.7%、85.2%、96.4%,差异均具有统计学意义(P=0.000)。两两比较结果显示,高级别鳞状上皮内病变与宫颈鳞状细胞癌两组中p16、p125的表达阳性率明显高于慢性宫颈炎或低级别鳞状上皮内病变组。四种不同宫颈病变中p16、p125的表达阳性率呈正相关。HPV分型结果显示慢性宫颈炎、低级别鳞状上皮内病变、高级别鳞状上皮内病变及宫颈癌四组中高危型HPV感染率分别为:61%、77%、76%、78%,差异无统计学意义(P=0.323),而四组感染HPV16/18的比率分别为:18%、17%、47%、64%,差异具有统计学意义(P=0.000)。两两比较结果:高级别鳞状上皮内病变或宫颈鳞状细胞癌两组中HPV16/18的表达阳性率明显高于慢性宫颈炎或低级别鳞状上皮内病变组。结论 p16、p125的表达检测对鉴别高级别鳞状上皮内病变与低级别鳞状上皮内病变或慢性宫颈炎具有非常重要的辅助诊断价值,且p125固定表达于细胞核,免疫组织化学染色结果更易判断,更易于临床应用;联合检测p16、p125及进行HPV分型更有助于判断宫颈鳞状上皮内病变的级别及宫颈病变进展的风险度评估。

POLD1基因突变及蛋白表达在胃癌组织中的临床意义

目的:观察DNA聚合酶δ(polymerase data, Polδ)的催化亚基p125与胃癌细胞恶性增殖的关系,并探讨p125的编码基因POLD1与胃癌发生、发展的关系。方法:采用免疫组化法检测胃癌组织及癌旁组织中p125的表达;沉默胃癌细胞中POLD1基因,用MTT实验检测POLD1基因沉默前后胃癌细胞的增殖速率。采用Sanger测序法对胃癌细胞株MGC-803中POLD1基因cDNA进行测序。结果:免疫组化结果显示,胃癌组织中p125表达明显高于癌旁组织。MTT实验结果显示,POLD1基因沉默的胃癌细胞生长速率明显低于对照组细胞。Sanger测序结果显示,胃癌细胞中POLD1基因cDNA的碱基序列发生了4处点突变,1个碱基插入,1个碱基缺失。结论:p125高表达与胃癌细胞恶性增殖相关;胃癌细胞中POLD1基因cDNA碱基序列发生点突变、碱基插入从而引起其氨基酸序列改变,这有可能是导致胃癌细胞中p125高表达并引起癌细胞恶性增殖的分子机制之一。

沉默CDC6基因对结肠癌细胞增殖的影响及机制的初步研究

目的:探讨沉默CDC6表达对结肠癌细胞增殖的影响及可能作用的机制。方法:筛选高表达CDC6结肠癌细胞株,构建CDC6-shRNA慢病毒载体,感染结肠癌细胞,RT-qPCR、Western blotting验证。CCK8法、细胞克隆形成、流式细胞周期实验分别检测转染前后结肠癌细胞增殖及细胞周期变化。Western blotting检测各组ERK、pERK、AKT、pAKT蛋白水平。结果:CDC6在结肠癌SW620细胞中高表达,shRNA-CDC6慢病毒感染后,CDC6 mRNA及蛋白表达明显降低,敲减率达到82.2%(P<0.01)。CDC6表达沉默后,CCK8实验结果显示,结肠癌细胞增殖速率明显下降,72小时抑制率达21.0%(P<0.05);细胞克隆实验也显示,干扰组结肠癌细胞克隆形成能力显著下降,相对对照组,干扰组细胞克隆数减少52.1%(P<0.01)。流式细胞周期实验显示,相对对照组,干扰组细胞G_(0)/G_(1)期的细胞比例升高,从44.12%增加到55.03%(P<0.05)。Western blotting实验结果显示,CDC6表达下调后,干扰组结肠癌细胞pERK、AKT及pAKT蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论:沉默CDC6基因表达能抑制结肠癌细胞的增殖能力,可能与抑制ERK及AKT信号通路活性有关。

p21调控胃癌POLD1基因的初步机制探究

目的分析p21调控胃癌POLD1基因表达的初步机制,以探索基于降低胃癌POLD1基因表达并阻断癌细胞恶性增殖的分子靶点。方法利用生物信息学软件Cytoscape、String分析p21与POLD1基因的相互关系;干扰胃癌细胞中p21基因的表达,采用荧光定量PCR及Western blot法检测POLD1基因及细胞周期调控因子CDK2、CDK4、p53、PCNA的表达变化,采用免疫共沉淀实验分析p21与POLD1基因编码的蛋白p125之间的相互作用。结果生物信息学分析发现,p21通过CDK2、PCNA与POLD1直接关联,并与CDK4等细胞周期因子间接相关。干扰胃癌细胞中p21的表达后,POLD1、CDK2、CDK4表达上调,而p53表达下调。免疫共沉淀实验未检测到p21与p125直接相互作用。结论p21能负调控胃癌中POLD1基因的表达,这种调控作用与细胞周期调控因子CDK2、CDK4、p53、PCNA等密切相关。

甲状旁腺癌1例

患者男性,34岁, 2016年12月因腰腿痛1个月余入院。血钙3.45 mmol/L, 甲状旁腺激素(PTH)426.6 pg/mL。超声示右侧甲状腺 结节,临床行右侧甲状旁腺及右叶大部分甲状腺切除术 。术中见右侧甲状旁腺肿物,最大径3.5 cm,界尚清, 质硬,有包膜。PTH及血钙:术前患者PTH 422.3 pg/mL ,血钙2.6 mmol/L;术后15 min患者PTH 73.4 pg/mL 、血钙2.46 mmol/L。

DNA聚合酶δ与肿瘤的关系

DNA聚合酶δ是参与真核生物DNA合成、损伤与修复、细胞周期调控等过程的重要聚合酶之一。近期有研究发现原发性肝癌组织中DNA聚合酶δ催化亚基p125表达水平较癌旁组织高,也有研究发现肺癌组织中DNA聚合酶δ第4个亚基p12低表达,且在结肠癌组织及细胞系中发现DNA聚合酶δ催化亚基p125的编码基因POLD1发生突变。这些均说明DNA聚合酶δ的异常与肿瘤的发生、发展有着非常重要的关系。

海南婴儿感染犬复孔绦虫病例报告

报告1例4个月龄的婴儿感染犬复孔绦虫的诊断和治疗。