小桐子磷脂二酰甘油酰基转移酶(JcPDAT1) cDNA的克隆与功能鉴定

使用简并PCR结合RACE技术从能源植物小桐子种子中克隆了一个PDAT基因的cDNA全长,命名为JcPDAT1(GenBank登陆号为HQ827796)。JcPDAT1全长2 869bp,包含一个长为2 013bp的开放阅读框,编码670个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物PDAT高度同源,具有典型的PDAT结构域。Realtime PCR结果表明JcPDAT1在种子、叶和根里面都有表达,且在种子发育过程中大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有PDAT酶活性。在与酿酒酵母突变体H1246α的互补实验中发现,TLC层析(薄层层析法)和尼罗红染色结果都显示JcPDAT1的表达使H1246α恢复合成TAG,说明JcPDAT1具有PDAT的功能活性。

正交设计优化莲藕ISSR-PCR反应体系研究

利用正交实验设计的方法,对莲藕ISSR-PCR反应的四因素(TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度)三水平进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL的ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为:10×PCRbuffer 2.0μL、dNTP150μmol/L、引物1.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L和TaqDNA聚合酶4 U,最佳模板DNA浓度为40～60 ng,引物U826的最佳退火温度为48.7℃。

烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因(NtDGAT2)的克隆与功能分析

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT2)是植物储存油脂生物合成过程中的关键酶,对种子储存油脂累积具有重要的生理作用。本文采用电子克隆与实验相结合的方法,从烟草种子cDNA中克隆到DGAT2基因的开放阅读框序列,命名为NtDGAT2(GenBank登录号JX843807),其序列长999bp,编码332个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物DGAT2具有较高相似性和典型的DGAT2结构域。利用Real-time PCR定量表达分析显示Nt-DGAT2在烟草种子、花、茎、叶和根里面都有表达,且在发育中的种子和花的发育过程大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有DGAT酶活性。

星油藤FAD3的N端序列对α-亚麻油酸累积的影响

植物脂肪酸脱饱和酶3(FAD3)是催化亚麻油酸(ALA)合成的关键功能酶。本研究通过对7种油料植物(其种子ALA含量显著不同)FAD3氨基酸序列进行比对发现,不同物种FAD3氨基酸N端序列变化较大,所带净电荷数也有较大的差异。利用小桐子(其种子不累积ALA)FAD3(JcFAD3)和星油藤FAD3(PvFAD3)核酸序列N端的置换,本研究获得了2个新的序列JcFAD3/Pv FAD3和Pv FAD3/JcFAD3。进一步在酵母中表达,发现JcFAD3在酵母系统中具有更高的催化活性,而且在30℃条件下N端序列置换不影响JcFAD3和Pv FAD3酶的脱饱和活性。在20℃条件下培养转化酵母菌株,发现含有星油藤Pv FAD3的N端序列的转化菌株能累积更高的ALA。结果显示在较低的温度下,Pv FAD3的N端序列可能因为富含酸性氨基酸(带负电荷),延缓了蛋白的泛素化降解过程,从而促进了ALA的合成。本研究对理解低温促进星油藤种子ALA累积的生理机制提供了新的依据。