青黛微生物发酵工艺初步研究

目的:研究青黛炮制中的微生物发酵工艺。方法:采用微生物技术、高压液相色谱法研究青黛炮制过程中微生物发酵作用。结果:温度和微氧是青黛炮制过程中影响发酵的关键因素。结论:证明了真菌在青黛炮制中有着重要作用。

γ-多聚谷氨酸吸附铜离子的研究

γ多聚谷氨酸(γPolyglutamicacid,以下简称γPGA)是一种由微生物发酵合成的新型多聚氨基酸.将γPGA与明胶膜交联可制成重金属吸附剂.结果表明,在制备明胶膜的同时加入γPGA,以浓度为0.1%的戊二醛溶液作为交联剂,在20℃条件下交联2h能更好地将γPGA与明胶相结合.采用初始浓度为100×10-6g/mL的Cu2+溶液在30℃条件下吸附4h能够达到最大吸附量.研究证明,γPGA确实对于重金属离子具有很强的吸附作用.

流式细胞术检测细胞存活率的方法学建立

目的探讨流式细胞术测定细胞存活率的可行性及准确性，为药物筛选、细胞增殖测定、药物毒性检测等提供新的选择。方法使用流式细胞术、CCK8比色法以及台盼蓝染色排除法测定Jurkat细胞存活率。结果使用流式细胞术，细胞浓度大于10^5／mL时，CV值小于5％；细胞浓度小于10^4／mL时，CV值为5％～10％。使用流式细胞术r^2为0．9935，斜率为0．9994；使用CCK8比色法r^2为0．9912，斜率为1．011；使用台盼蓝染色排除法r^2为0．9698，斜率为1．057。结论流式细胞术进样流速稳定，且与活细胞数量成正比，可用于测定细胞存活率。

16S rDNA序列分析鉴定一株芽孢杆菌

利用16S rDNA分析对芽孢杆菌Y-2进行系统进化鉴定。首先提取菌株Y-2的基因组DNA,经PCR扩增后,测定其16S rDNA序列,将测序结果与NCBI上已知菌种的16S rDNA序列进行BLAST对比,构建系统进化树进行分析,最终鉴定该菌株为枯草芽孢杆茵(Bacillus subtilis),其同源性≥99%。

多表位疫苗的构建策略及其在动物疫苗中的应用

多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型分子疫苗。由于具有安全性好、保护力强和应答类型可以有效调控等优点,多表位疫苗具有较高的研究和应用价值。多表位疫苗因其独特的免疫优势已成为近年来基因工程疫苗研究领域的热点之一。本文概述了表位的预测筛选、多表位疫苗的设计与优化及其在动物医学领域的应用等方面的进展。

酯蟾毒配基选择性杀伤肿瘤细胞的研究

背景与目的:酯蟾毒配基是我国传统抗肿瘤中药-蟾酥主要成分之一。前期的研究表明,酯蟾毒配基能在不影响静息人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)存活的浓度下杀伤肿瘤细胞,本研究将进一步探讨酯蟾毒配基是否具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用。方法:分别将酯蟾毒配基作用于Jurkat细胞、Hep3B细胞、PBMC以及PHA活化后PBMC。采用CCK-8显色法对肿瘤细胞生长抑制率进行测定;利用流式细胞术对药物作用PBMC前后细胞数量进行精确计数。结果:酯蟾毒配基对Jurkat和Hep3B肿瘤细胞有明显杀伤作用,而对静息PBMC细胞影响轻微。喜树碱、多柔比星和依托泊苷同酯蟾毒配基相似,对静息的PBMC没有影响,却能杀伤PHA活化后的PBMC。结论:酯蟾毒配基同其他抗肿瘤药物一样,都作用于肿瘤细胞增殖环节,而非选择性杀伤肿瘤细胞;强心苷类化合物选择性杀伤肿瘤细胞的观点不确切。

携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究

为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p<0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2+浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2+浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。

流式细胞术检测细胞亚群存活率的应用研究

目的采用流式细胞术直接检测小鼠脾细胞中T细胞与Treg细胞存活率,探讨流式细胞术测定混合细胞中细胞亚群存活率的可行性。方法荧光抗体及碘化丙锭联合使用,测定小鼠脾细胞中T细胞与调节性T细胞的存活率。结果使用流式细胞术测定脾细胞中T细胞存活率时,r2=0.9925,斜率为1.012;测定调节性T细胞存活率时,r2=0.9831,斜率为0.9823。结论流式细胞术可以应用于测定混合细胞中细胞亚群的存活率,为药物筛选提供新的选择。

黄芩微生物发酵产物的分离提取

采用筛选获得的β-葡萄糖醛酸酶产生菌HQ-10对黄芩中的主要前体物质黄芩苷进行发酵转化。产物经TLC、HPLC检测，确定为有效成分黄芩素（黄芩苷元）。通过正交实验对产物的分离提取条件进行优化，确定了最佳提取条件，黄芩素得率3．26％，是原药材含量的5．3倍。

医学院校科研实验中心建设与管理的探讨

医学院校的科研实验中心承担着学校的科研及教学工作,在学校的发展及人才培养中有着重要的作用。本文就成都医学院科研实验中心为例,对科研实验中心建设的意义、建设的情况及管理模式等方面进行了探讨。

利用流式监控高质量小鼠脾细胞的制备

目的流式技术监控小鼠脾细胞裂解过程,在确保脾淋巴细胞高活力的同时,充分裂解其中的红细胞。方法以流式细胞术监控ACK和Tris-NH4Cl两种红细胞裂解液的裂解效果,通过细胞融合率判断淋巴细胞活力。结果结合FSC和PI荧光强度分析,在确保淋巴细胞相对存活率大于或等于90%的前提下,ACK处理0.5～1min即可去除90%以上的红细胞,Tris-NH4Cl处理10min也可去除82%的红细胞,获得的淋巴细胞的融合效率为85%～90%。结论流式细胞术能够实时监控ACK和Tris-NH4Cl的裂解过程,获得高质量的脾淋巴细胞以适用于杂交瘤细胞的制备。

血小板制剂对细胞体外增殖活力影响的初步研究

目的探讨不同血小板制剂对细胞体外增殖活力的影响,并对其作用机制进行初步研究。方法制备不同血小板制剂:新鲜机采血小板、冰冻机采血小板、富血小板凝胶上清、乏血小板血浆等,以1640培养基为对照,与MM.1S细胞(多发性骨髓瘤细胞)在相同的培养条件下进行共培养,用流式细胞仪对培养后的细胞进行细胞计数,观察细胞的增殖情况。结果 1)单独的血小板及乏血小板血浆均对MM.1S细胞有促增殖作用,且促增殖效果与样品浓度成正相关。2)新鲜机采血小板对MM.1S细胞促增殖作用在各实验组中最高,新鲜机采凝胶上清和乏血小板血浆次之;二甲基亚砜对细胞增殖有抑制作用;凝血酶对细胞增殖无明显影响。3)血小板经过冰冻处理后,机采冰冻血小板与冰冻凝胶上清对MM.1S细胞促增殖作用较新鲜机采血小板和凝胶上清减弱。但机采冰冻血小板与冰冻凝胶上清对MM.1S细胞的促增殖作用存在剂量效应,在稀释浓度40-80倍左右时,具有相对较强的促增殖影响力。结论不同血小板制剂对MM.1S细胞的促增殖作用各有不同,此研究将为制备血小板凝胶选择原辅材料提供实验依据和参考。

补体C3基因敲除小鼠的繁育及子代基因型鉴定

目的探讨繁殖和鉴定补体C3基因敲除小鼠的实验方法。方法将所引进的补体C3基因敲除杂合子小鼠(C3+/-)进行饲养并繁殖,其子代出现三种基因型的小鼠,即纯合子C3-/-、杂合子C3+/-、野生型C3+/+,采用ELISA与PCR相结合对子代小鼠基因型进行鉴定。结果繁育出135只子代小鼠,经鉴定,C3+/+、C3+/-、C3-/-各为38只、68只、29只,经χ2检验,子代小鼠分离比例符合孟德尔遗传规律。结论正确的饲养繁殖以及子代鉴定是从杂合子小鼠中获得补体C3基因敲除小鼠的有效途径。

雪胆素甲诱导非小细胞肺癌系NCI-H460和A549的凋亡效应及其作用机制初探

目的雪胆素甲(CuⅡa)诱导肺癌NCI-H460和A549的凋亡效应及其作用机制初探。方法利用CCK-8检测CuⅡa对肿瘤细胞抑制活性;流式细胞术检测CuⅡa对肿瘤细胞凋亡以及周期的影响;Western blot检测CuⅡa对Aurora A、STAT3以及Cofilin蛋白磷酸化的影响。结果 CuⅡa对肺癌细胞NCI-H460和A549具有明显抑制作用,其IC_(50)分别为224.9和108.3 nmol·L^(-1);CuⅡa能诱导肿瘤细胞凋亡,并阻滞细胞周期于G_2/M期;Western blot实验结果显示CuⅡa对STAT3和Cofilin的磷酸化具有抑制作用,且呈现剂量依赖性,CuⅡa能抑制Aurora A磷酸化,符合Aurora A激酶抑制剂抗肿瘤效应重要特征—阻滞细胞于G_2/M期。结论CuⅡa对非小细胞肺癌细胞系NCI-H460和A549具有明显的抑制作用,CuⅡa可作为抗非小细胞肺癌的先导化合物进行下一步研究。

葫芦素E抑制多发性骨髓瘤细胞增殖及与阿霉素的协同效应

目的研究葫芦素E对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响,并观察葫芦素E与阿霉素的协同效应。方法采用CCK-8测定葫芦素E对4种多发性骨髓瘤细胞MM1.S、MM1.R、U266和RPMI8226的半数生长抑制率（GI50）,并通过CalcuSyn协同效应分析软件,计算药物合用指数（CI）,评价葫芦素E与阿霉素协同抗多发性骨髓瘤作用;流式细胞术检测葫芦素E对MM1.S、MM1.R的细胞周期、线粒体膜电位和细胞凋亡的影响;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的变化,以及葫芦素E对IL-10刺激的RPMI8226细胞STAT3蛋白磷酸化的抑制作用。结果葫芦素E对4种多发性骨髓瘤细胞的GI50均在（12.3～161.7）nM范围内;葫芦素E导致多发性骨髓瘤细胞的SubG1期细胞比例、凋亡细胞比例和线粒体膜电位下降细胞比例均明显增加,并出现凋亡相关的活化蛋白如Cleaved Caspase-3和Cleaved-PARP。葫芦素E能有效抑制IL-10诱导的RPMI8226细胞STAT3磷酸化,并能与阿霉素协同抗多发性骨髓瘤。结论葫芦素E通过抑制STAT3蛋白磷酸化,诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡,并能协同阿霉素抗多发性骨髓瘤。

甜瓜蒂中葫芦素提取工艺初探及其含量测定

目的比较65%乙醇和无水乙醇回流提取法从甜瓜蒂中提取葫芦素的效率;同时比较甜瓜蒂纤维和甜瓜蒂粉末中葫芦素含量的差异。方法分别采用65%乙醇和无水乙醇加热回流法制备甜瓜蒂粉末提取液;采用无水乙醇加热回流法制备甜瓜蒂纤维提取液。通过HPLC测定提取液中葫芦素B、E和I的浓度。结果甜瓜蒂粉末采用无水乙醇制备的提取液中葫芦素B、E浓度均高于65%乙醇制备的提取液中葫芦素B、E浓度,差异有统计学意义(P<0.05);但葫芦素I浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。甜瓜蒂纤维采用无水乙醇制备的提取液中也含有较高浓度的葫芦素B、E、I。结论采用乙醇加热回流法从甜瓜蒂中提取葫芦素,无水乙醇提取效率高于65%乙醇。甜瓜蒂粉末中葫芦素含量虽高于甜瓜蒂纤维,但甜瓜蒂纤维中仍有较高含量的葫芦素,不应当作废弃物处理。

传染性支气管炎病毒结构蛋白免疫鸡对CD4^+ CD8^+ T淋巴细胞亚群的影响

为了比较传染性支气管炎病毒3种主要结构蛋白免疫鸡后对CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的不同影响。本试验以pVAX1载体为携带工具,制备分别含有IBV主要结构蛋白基因的质粒免疫健康雏鸡,采用流式细胞仪(FACS)对免疫鸡外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞数进行检测。结果显示:各试验组间,携带N蛋白基因的质粒在免疫后3周内CD4+T淋巴细胞数和CD8+T淋巴细胞数均高于其他组,且差异极显著(P<0.01)。由此可见,IBV的N蛋白可明显诱导CD8+T淋巴细胞的CTL免疫作用和CD4+T淋巴细胞的辅助性免疫作用,其细胞免疫原性高于S1蛋白和M蛋白。

云南蕊木的研究进展

云南蕊木是傣族民间常用的中草药,主要含有具有多种生物活性的单萜吲哚生物碱。本文从化学成分、生物活性和临床应用3个方面综述云南蕊木的研究进展,以期为云南蕊木的更深入研究提供参考。