CaMV 35S启动子在菊花中驱动GUS外源基因的表达分析

[目的]由于CaMV 35S启动子转化菊花存在外源基因表达量低、基因沉默等问题,本研究对35S启动子、2×35S启动子在菊花中驱动GUS外源基因的表达进行了分析,以期为高效菊花转化提供理论指导。[方法]通过设计引物,利用PCR从p CAMBIA1301 Vector中克隆了35S启动子、2×35S启动子的序列并插入pORE R2载体中,分别获得了重组载体p ORE R2-35S:GUS和p ORE R2-2×35S:GUS,通过农杆菌介导法将构建的遗传转化载体分别导入切花菊品种‘神马’中。[结果]试验共转化2 296个菊花叶盘,经过筛选共得到16个过量表达的转基因株系。经PCR验证,目标片段已经成功插入转基因株系基因组。荧光定量PCR分析和染色分析显示,在转基因菊花中2×35S比35S启动子表现出驱动GUS基因高量表达的特性。[结论]在选择合适菊花品种的基础上,2×35S比35S启动子可以更加高效地促进基因表达。

菊花高效瞬时转化体系建立及稳定遗传植株再生

[目的]本试验的目的是通过瞬时转化解决菊花转基因中存在的两大难题:转化效率低和表达水平低。[方法]通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因(编码β-葡糖苷酸酶)的表达载体pORE R1-2×35S∷GUS转入菊花‘优香’叶片中,进行瞬时表达,并组织培养转化后的叶片,利用GUS化学染色法和RT-PCR进行转化植株鉴定。[结果]菊花‘优香’瞬时表达的转化效率高达76.7%,外源基因(GUS)的表达水平也较理想,尤以第4和第5片完全展开叶(从形态学上端向形态学下端数)表现最佳。经过3~4个月的组织培养和抗性筛选,瞬时转化的‘优香’叶片再生出稳定遗传的转基因株系,转化效率达38.9%。[结论]本试验提供的菊花瞬时表达的方法高效、简单,并能实现稳定遗传。

菊花磷脂酶Dα基因的耐逆表达特性

本研究设计了切花菊‘神马’磷脂酶Dα基因(CmPLDα)的特异性引物,利用荧光定量的方法分析了CmPLDα的组织表达特性及其在非生物胁迫、脱落酸(ABA)、黑斑病接种处理下的表达特性,研究了菊花CmPLDα在胁迫应答中的作用。结果表明:CmPLDα在根、茎、叶、花等组织均有表达,在茎、叶、花中表达量较高,在根中表达较低;CmPLDα的表达几乎不受低温影响,整体上受机械损伤抑制,受高温明显抑制,受缺磷显著诱导,盐胁迫诱导了胁迫后期CmPLDα的增加,CmPLDα受ABA处理的快速诱导;黑斑病菌接种2 d后也可诱导CmPLDα的表达。由此可知,CmPLDα为组成型表达,该基因参与了菊花多种胁迫过程,包括温度、缺磷、ABA信号及黑斑病等。