基于动态互相关性和折叠自由能变分析的谷氨酰胺转氨酶热稳定性改造

茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)能催化蛋白质交联,被广泛用于食品加工。前期研究构建了S.mobaraensis TGase耐热突变体FRAPD-TGm2,提高了其在高温条件下的应用性能。该研究基于动态互相关性鉴定得到热稳定性进一步提高的TGase突变体。首先,通过分子动力学模拟和动态互相关性分析确定了FRAPD-TGm2分子中与其底物口袋柔性区域具有动态互相关性的48个残基。其次,基于Rosetta Cartesian_ddg对上述残基进行虚拟饱和突变,对折叠自由能变化小于-1 kcal/mol的20个突变体进行表达、纯化和酶学性质表征。其中,突变体FRAPD-TGm2-Y34 W的60℃半衰期和65℃比酶活力分别达到100.5 min和134.2 U/mg,较FRAPD-TGm2提升89.1%和28.5%。此外,发现了远端位点His201和Asn32对FRAPD-TGm2比酶活力和热稳定性具有显著影响。结果表明,基于动态互相关性和折叠自由能变分析的酶分子改造能有效提高TGase的热稳定性。

β-葡萄糖苷酶催化活性改造及在毕赤酵母中的高效表达

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基,是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好,但催化活性还亟待提高。该研究中,通过Discovery Studio 2022柔性对接模块构建了bgl3A和底物pNPG的复合物结构;基于结合能预测模块对bgl3A催化活性位点6以内的氨基酸残基进行虚拟突变,计算突变前后酶对pNPG的结合能变化;对结合能变化小于-0.7 kcal/mol的20个突变体进行表达、纯化和酶学性质分析。与bgl3A相比,突变体bgl3A-N237Y的比酶活和k_(cat)/K_(m)分别提升了22%和25%。将bgl3A-N237Y在毕赤酵母中表达,通过信号肽替换和共表达分子伴侣使其摇瓶发酵酶活力达106.6 U/mL,较优化前提高75%。研究得到高活性bgl3A突变体及其生产菌将有助于提高其工业化应用效果。

黑曲霉酸性果胶裂解酶在大肠杆菌中的表达和酶学性质研究

酸性果胶裂解酶能以β-反式消去作用断裂果胶中的α-1,4糖苷键形成不饱和寡聚半乳糖醛酸,对食品等工业中高酯化果胶降解具有重要意义。该研究将黑曲霉Aspergillus niger AG11来源的酸性果胶裂解酶(pelA)在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,并进行了蛋白标签优化和酶学性质研究。最终确定在N端融合碳水化合物结合结构域(carbohydrate-binding structural domain,CBM)时,pelA的胞内酶活力最高,达到3.25 U/mL,比初始条件下提高4.12倍。对CBM切除前后pelA的酶学性质进行测定,结果表明pelA的比酶活力、最适反应温度及最适反应pH分别为15.45 U/mg、40℃和5.0,pelA在30~50℃孵育2 h保持80%以上活性,这与pelA+CBM相同,在40℃、pH为4.0~5.0时孵育2 h,相对酶活力保持在60%以上,此时pelA+CBM具有80%以上的活性。以柑橘果胶为底物,pelA的K m和k cat分别为4.44 mmol/L和31.44 s^(-1)。该研究结果为pelA的分子改造和在工业生产中的应用奠定了基础。