Ion Torrent PGM^(TM)测序在急性髓系白血病检测中的应用

目的探讨Ion Torrent PGMTM测序平台用于急性髓系白血病(AML)患者基因突变检测的可行性。方法提取27例AML患者初次治疗前的骨髓DNA,用Ion Torrent PGMTM测序仪对50个常见的肿瘤基因热点突变区进行检测,同时用Sanger测序法检测FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)和核仁磷蛋白1(NPM1)基因的突变情况以进行验证。结果 50个目标基因中检出17个基因共29个突变位点,单个基因有多种突变方式,以单碱基替换为主。突变频率最高的是NPM1(22.2%)和FLT3(18.5%)。用Sanger测序法验证,NPM1两种方法检测的吻合度为100%,在FLT3验证中,其中有1例Sanger测序为阳性,而Ion Torrent PGMTM检测为阴性。结论 Ion Torrent PGMTM能够在短时间内得到AML患者的基因突变谱,但其在检测长片段插入/缺失中的缺陷仍需改进。

造血干细胞移植后BK病毒监测的临床意义

本研究旨在建立造血干细胞移植后BK病毒(BKV)感染的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。根据BKV基因序列设计引物,构建用于检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测BKV的方法,并对36例造血干细胞移植术后患者的尿液标本中BKV含量进行检测。结果表明:成功构建了BKV的定量标准品和荧光定量PCR检测BKV的方法,并经过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证;在36例造血干细胞移植患者中有20例尿液定量检测出BKV,阳性率为55.56%,尿液负荷量BKV拷贝数为2.46×104-7.8×109/ml。结论:BKV实时荧光定量PCR检测方法的建立对造血干细胞移植后出血性膀胱炎的早期诊断、预防、治疗具有重要意义。

结肠腺瘤和结肠癌基因表达谱分析

目的研究结肠腺瘤、结肠癌基因表达谱,筛查结肠癌相关基因。方法用BRB-Array Tools对公共基因芯片数据库GEO中的结肠腺瘤、结肠癌基因芯片表达数据进行统计学分析,找出在结肠腺瘤和结肠癌发生发展中均发生变化的基因及二者的特异性基因,进一步分析其功能。结果样本聚类表明各类组织分类正确,比较后得到在腺瘤和腺癌中共同表达的104条基因,其中48条共同上调,56条共同下调;差异基因的功能涉及物质代谢、内环境稳态、细胞间通讯、细胞黏附、细胞增殖等多种肿瘤发生发展的重要生物学过程。结论生物信息学方法发现的结肠腺瘤、结肠癌基因表达谱可为结肠癌的发病机制及治疗靶位的研究开辟新思路。

Ion Torrent PGM测序技术在MPN患者临床诊断中的方法学建立

目的:探讨通过自主设计定制的MPN致病相关基因的多重PCR引物试剂盒,使用Ion Torrent PGM第二代测序平台快速和准确地获取MPN患者基因突变信息的可行性和可靠性。方法:收集2015年1月至2015年10月就诊于南方医院血液科,经Sanger测序法检测JAK2V617F+和(或)CALR+、Ph-的10例MPN患者骨髓标本,然后使用Ion Torrent PGM第二代测序复核检测骨髓并对比两种方法结果的一致性。结果:Ion Torrent PGM第二代测序检测JAK2V617F、CALR和MPL就这3个基因而言,所有样本CALR基因52 bp缺失均未被检测出,其余测序结果与Sanger测序结果完全一致。结论:Lon Torrent PGM测序平台检测MPN患者多个基因突变,方法上具有可行性,能满足临床检测需求。本研究方法在1-2 d内可完成23个基因突变检测,具有灵敏、特异、快速、高通量及低成本的优势。

伊马替尼治疗慢性期慢性粒细胞白血病的随访观察

目的:通过对117例慢性期慢性粒细胞白血病(CML)患者应用伊马替尼治疗的随访观察,总结其疗效。方法:117例慢性期CML患者,慢性早期95例,慢性晚期22例,伊马替尼中位治疗剂量为400(200～800)mg/d。初次服用患者分别于第3、6、12个月定期复查。以服药6个月时治疗反应分为完全细胞遗传学缓解(CCyR)组、部分细胞遗传学缓解(PCyR)组和无细胞遗传学缓解(NCyR)组,Kaplan-Meier法分析比较无进展生存(PFS)。结果:117例CML患者CCyR率为82.1%,75.0%在6个月内获得CCyR,原发耐药率为10.3%,死亡率为4.3%。慢性早期患者比慢性晚期患者获得CCyR率高,但无统计学差异,P=0.208;而慢性晚期患者的原发耐药率显著增高,P=0.013。慢性早期和慢性晚期的总生存率分别为93.2%和94.7%,P=0.939。以服药6个月时治疗反应分组,CCyR组、PCyR组及NCyR组5年PFS率分别为90.0%、41.9%和0,P=0.000。结论:伊马替尼治疗慢性期CML患者6个月内获得CCyR者PFS率明显高于未获得CCyR者,慢性早期患者疗效优于慢性晚期患者。

尼洛替尼治疗伊马替尼耐药或不耐受的慢性粒细胞白血病的长期随访研究

目的评价对伊马替尼耐药或不耐受的慢性粒细胞白血病(CML)患者接受尼洛替尼治疗的远期疗效和安全性。方法 26例对伊马替尼耐药或不耐受CML患者接受尼洛替尼400～800 mg/d治疗,随访观察近5年,定期监测血液学、细胞遗传学及分子生物学指标,记录用药后患者临床表现及各项生化指标,评价其疗效、不良反应。结果 26例对伊马替尼耐药或不耐受的CML患者,尼洛替尼中位治疗时间17个月,中位随访时间51个月。累计获得完全血液学缓解(CHR)16例(61.5%),获得主要细胞遗传学缓解(MCyR)13例(50.0%),获得完全细胞遗传学缓解(CCyR)9例(34.6%),获得主要分子生物学缓解(MMR)7例(26.9%)。尼洛替尼治疗相关的非血液学不良反应多为l～2级,主要为胆红素升高(69.2%)和皮疹(57.7%)。3～4级血液学不良反应包括血小板减少(53.8%)、中性粒细胞减少和贫血(分别为26.9%和19.2%)。相比进展期患者,尼洛替尼对慢性期和缓解期的患者疗效更佳、血液学副作用更少。结论尼洛替尼为对伊马替尼耐药和不耐受的CML患者提供了一个有效并安全的治疗选择,尤其对非进展期CML患者更为安全和有效。

T315I基因突变的慢性髓性白血病临床特征及泊那替尼疗效

目的分析伴T315I突变的慢性髓系白血病(CML)的临床特征及不同治疗方法的疗效。方法回顾性分析19例行BCRABL KD突变检测T315I突变的CML患者的临床资料及不同治疗的预后,通过直接测序分析获得用于RTQ-PCR样品的BCRABL KD突变。用Sanger测序法对BCR-ABL KD突变进行测序。复发标准包括血液学复发、细胞遗传学复发和分子生物学复发。结果 19例CML-T315I患者,初诊时73.7%(14/19例)患者处于慢性期(CP),Sokal评分中高危患者占81.2%(13/16例)。19例患者初诊后均行酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗,病程中78.9%(15/19例)患者有附加染色体畸变,52.6%(10/19例)患者存在多重突变。68.4%(13/19例)的患者在疾病进展后(加速期/急变期)检测出T315I突变,从初诊到检测出T315I突变的中位期为40 m(5～120 m)。突变后12例行泊那替尼治疗(A组),7例选择传统化疗方案(B组)。A、B两组3年总生存率分别是83.3%和14.2%(P=0.001)。结论小样本回顾性研究发现对TKI耐药的CML患者易检出T315I突变,进展期检出率明显高于慢性期。此类患者往往合并附加染色体和多重基因突变,预后较差,即行异基因造血干细胞移植,复发率仍较高。泊纳替尼长期维持治疗,可能会改善预后,延长生存期。

急性髓细胞白血病患者EZH2表达及其与髓外浸润关系的研究

目的:探究EZH2基因在急性髓细胞白血病(AML)细胞表达及其与髓外浸润关系。方法:应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测42例AML患者骨髓细胞EZH2 mRNA表达,采用免疫组织化学方法检测16例AML患者髓外浸润组织中EZH2蛋白表达水平,并分析EZH2表达与临床特征及预后的关系。结果:42例AML患者骨髓细胞EZH2 mRNA表达水平显著高于正常对照组(P=0.005),EZH2 mRNA表达水平与男性、外周血幼稚细胞比例≥60%、WBC≥35×109/L及发病时伴有髓外浸润显著相关,且与外周血幼稚细胞比例和WBC计数呈显著正相关(P=0.009、P=0.023),另外伴有髓外浸润组EZH2 mRNA表达显著高于无髓外浸润组(P=0.001)。16例AML髓外浸润组织中,10例患者阳性表达EZH2蛋白,且其中7例患者中至强阳性程度表达EZH2。结论:EZH2在AML患者中高表达,可能通过某种机制参与白血病细胞髓外浸润的过程。

FLT3-ITD基因突变及其碱基重排长度对急性髓系白血病的预后影响

目的:探讨FLT3-ITD基因及其碱基重排长度对急性髓系白血病(AML)患者总体生存时间(OS)及无复发生存时间(RFS)的影响。方法:回顾分析2011年6月至2016年4月收治的75例FLT3-ITD^+ AML(除外M3)及76例FLT3-ITD^-正常核型AML(除外M3,作为对照组)患者临床资料;采用DNA基因测序分析40例FLT3-ITD^+ AML患者ITD基因重排碱基长度。结果:FLT3-ITD^+ AML患者初诊时白细胞数、骨髓原始细胞比例较FLT3-ITD^- AML患者高(95.13 vs 10.85(P<0.01);72%vs 59%,P=0.003),CR率较FLT3-ITD^-患者低(70.42%vs 94.7%(P<0.01)。接受造血干细胞移植的FLT3-ITD^+患者OS及RFS明显长于单纯化疗FLT3-ITD^+患者(P<0.01),且移植后早期接受索拉菲尼维持治疗患者OS和RFS较未接受者明显延长(P<0.05和P<0.05)。FLT3-ITD插入重排碱基长度<60 bp组OS长于≥60 bp(P<0.05),其中2组单纯化疗患者OS及RFS差异无统计学意义。而在接受异基因造血干细胞移植患者中,重排碱基长度<60 bp组OS长于≥60 bp组(中位OS分别未达到、达到、15个月,P<0.05),且与allo-HSCT FLT3-ITD^-患者OS相似。结论:FIT3-ITD^+ AML患者(除外M3)预后较FLT3-ITD^-患者差,其中ITD重排碱基长度≥60 bp患者预后更差,单纯化疗并不能改善FLT3-ITD^+患者的预后。造血干细胞移植能够明显延长RFS,移植后早期索拉菲尼维持治疗能显著改善这类患者的预后。

宫颈癌淋巴结转移相关基因的表达谱研究

淋巴结转移是影响宫颈癌预后因素的首要因素,但分子机理尚不清楚,探讨宫颈癌淋巴结转移的分子机制,筛选可能用于临床诊断和治疗的新的分子靶标尤其重要.BRB-Array Tools软件对基因表达综合数据库(Gene Expression Ominibus,GEO)中有/无淋巴结转移早期宫颈癌的基因芯片表达谱数据进行统计学分析,找出二者的差异基因,利用GenCLip软件进行文献挖掘研究这些差异表达基因的功能关系.筛选出71个差异表达基因,其中35个在有淋巴转移的宫颈癌中表达上调,36个下调.文献挖掘发现FZD10、PDZK1IP1、SERPINB9、COMP、MAGEA1等几个新的宫颈癌淋巴转移相关基因.结果表明生物信息学方法能有效地分析基因芯片数据并获取生物内在信息,为宫颈癌淋巴转移发生机制及治疗靶位开辟新思路.

+8伴JAK2突变的骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病不能分类1例

本研究探讨1例骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病不能分类(MDS/MPD-U)患者的临床特征、染色体核型与JAK2基因突变发生的关系。利用骨髓组织学活检、染色体核型分析技术、ARMS-PCR等方法,观察该MDS/MPD-U患者的临床特征、染色体核型、JAK2基因突变情况。结果表明,患者骨髓有典型的小巨核细胞、血小板增多、8号染色体三体异常、JAK2 V617F基因突变。结论:该患者符合MDS/MPD-U的诊断,伴有+8,JAK2 V617F基因突变,为进一步研究染色体核型异常与JAK2 V617F基因突变两种分子事件之间的相关性及对MDS/MPD-U预后的影响提供依据。

miR-365a-3p通过BMI1基因影响结直肠癌干细胞特性抑制结直肠癌发生发展的机制研究

目的 研究mi R-365a-3p在结直肠癌组织中的表达,明确其在结直肠癌发生发展中的作用。方法 收集南方医科大学南方医院2018年9月至2019年9月住院患者的结直肠癌标本,通过Q-PCR方法检测43对癌及癌旁正常组织中miR-365a-3p的表达,分析其与患者T分期的关系;通过生物信息学网站、双荧光素酶实验验证mi R-365a-3p与B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(BMI1)基因的关系;设定空白为对照组,mi R-365a-3p为实验组,miR-365a-3p抑制剂为干扰组;通过CCK8及干细胞成球实验检测三组细胞增殖能力及干细胞成球能力;通过Q-PCR方法检测三组细胞中CD44、CD133及Lgr5的表达。结果 mi R-365a-3p在正常组织中的表达高于癌组织(P <0.05);miR-365a-3p与BMI1结合后,实验组中CD44、CD133及Lgr5表达下降,而干扰组升高(P <0.05);实验组细胞的增殖及成球能力下降,而干扰组升高(P <0.05)。结论 miR-365a-3p通过结合BMI1基因下调干细胞相关基因的表达,进而抑制结直肠癌的发生发展。

骨髓增殖性肿瘤JAK2基因突变分析及临床诊断意义

目的探讨JAK2基因突变在骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPNs)患者中的诊断价值。方法采用扩增受阻突变PCR(amplification refractory mutation PCR,ARMS-PCR)的方法检测原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)4例、真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV)4例、慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)5例、慢性特发性骨髓纤维化(chronic idiopathic myelofibrosis,CIMF)1例和15例疑似MPNs的骨髓或外周血白细胞基因组JAK2 V617F点突变。结果 29例患者中共发现11例(37.9%)JAK2V617F突变,8例为杂合型突变,3例为纯合型突变;其中ET中2例(50.0%),PV中2例(50.0%),CIMF中1例(100.0%),疑似MPNs患者6例(40.0%),未发现CML患者有突变病例。结论 JAK2 V617F突变为bcr/abl阴性MPNs患者主要的分子遗传学异常标志,可作为临床诊断的指标之一,同时,ARMS-PCR方法能够检测出突变是杂合型还是纯合型。

WT1基因在骨髓增生异常综合征患者骨髓中的表达及其临床意义

目的:探究WT1基因在骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓中的表达水平及其临床意义。方法:回顾性分析2017年1月至2021年4月在南方医科大学南方医院就诊的147例初发MDS患者的临床资料,应用实时荧光定量PCR检测骨髓WT1基因表达,根据其表达水平分为WT1^(+)和WT1^(-)两组,分析两组患者的临床特点和预后。结果:147例MDS患者WT1^(+)率为82.3%。WT1^(+)和WT1^(-)两组患者的骨髓原始细胞比例、异常染色体核型、WHO 2016分型及IPSS-R危险分层差异均有统计学意义(均P<0.05);MDS亚型恶性程度及IPSS-R危险分层越高,WT1表达水平越高。WT1^(+)和WT1^(-)两组患者中位OS、进展为白血病时间差异均无统计学意义(均P>0.05)。在未移植患者中,WT1^(+)患者中位OS较WT1^(-)患者显著缩短(P=0.049)。WT1^(+)移植患者预后明显优于去甲基化治疗患者(P=0.002),且死亡率低(P=0.005)。结论:WT1基因表达水平可用于评估MDS患者病情,与MDS患者预后密切相关。

芦可替尼治疗骨髓纤维化阶段性疗效及安全性评估

目的评价芦可替尼治疗骨髓纤维化(myelofibrosis,MF)患者的疗效及安全性。方法回顾MPN症状评估表(MPN-SAF-TSS)评价症状,B超评估脾脏大小,观察骨髓纤维化及JAK2V617F基因突变负荷变化和不良反应情况,同时探讨芦可替尼对患者免疫功能的影响。结果服用芦可替尼12个月,51.67%的MF患者总症状评分降低50%以上;脾脏中位长厚径分别由基线的(16.65±3.42)、(5.86±1.54)cm,缩短至(14.93±3.02)、(5.32±1.29)cm,差异有统计学意义(P<0.001);92.86%患者骨髓纤维化稳定或改善,45例患者合并JAK2V617F等位基因突变,基因突变负荷中位差异无统计学意义(P=0.600)。血液学不良反应主要为贫血(68.09%)和血小板减少(40.43%);非血液学不良反应主要观察到感染的发生(23.33%);用计学意义(P=0.020)。结论随访1年的结果显示芦可替尼用于治疗骨髓纤维化患者是安全且有效的。

急性髓系白血病患者血清sPD-L1、VEGF表达及相关性

目的探讨急性髓系白血病患者血清可溶性程序性死亡因子配体-1(sPD-L1)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达及相关性。方法选择2015年1月~2018年1月广东省东莞康华医院(以下简称“我院”)收治的89例急性髓系白血病患者为研究对象,纳入观察组,另选取我院同期进行健康体检的健康受试者50名为对照组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组受试者的sPD-L1、VEGF水平,并进行组间比较。对观察组患者进行2个月标准化治疗,根据疗效判断标准将患者分为完全缓解(CR)组36例、部分缓解(PR)组40例和未缓解(PD)组13例,对三组患者的sPD-L1、VEGF水平进行检测比较,并对sPD-L1与VEGF的相关性进行分析探讨。结果治疗前,观察组患者sPD-L1、VEGF水平均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组经治疗后,CR组和PR组患者sPD-L1、VEGF水平均显著低于PD组,且CR组患者sPD-L1、VEGF水平低于PR组,差异有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关性检验分析,患者治疗前、治疗后血清sPD-L1与VEGF均呈显著的正相关性(r=0.447、0.327,均P<0.05)。结论急性髓系白血病患者sPD-L1、VEGF呈现高表达,随着预后效果的好转,其表达水平不断降低。因此,sPD-L1、VEGF水平的检测对于急性髓系白血病的诊治和预后评估有一定辅助作用和临床价值。

FIS1对急性髓细胞白血病患者预后的意义

目的:探讨FIS1基因在正常核型急性髓系白血病(AML)中的表达及临床意义。方法:用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术测定47例初诊的原发、正常核型AML患者骨髓单个核细胞中FIS1 mRNA表达,western blot检测5例难治性与6例非难治性AML患者FIS1蛋白表达,分析其与临床特征及治疗反应之间的关系。结果:FIS1 mRNA表达水平在首疗程NR的AML患者中显著高于首疗程CR的患者(P=0.002);难治性AML患者FIS1 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于非难治性患者(P=0.028,P=0.000)。高表达FIS1的AML患者3年、5年死亡率均显著升高(P=0.000,P=0.000),OS和RFS均显著缩短(P=0.018,P=0.045);Cox回归分析提示FIS1高表达是AML患者预后危险因素(HR=6.767,P=0.009)。结论:FIS1基因高表达与难治性AML及AML患者预后不良有关。

GEO-基因表达综合数据库的应用与数据挖掘

高通量微阵列杂交技术和测序技术的快速发展，产生了大量的基因数据，生物信息迅速膨胀成为数据的海洋。为适应这种高通量基因表达数据的不断增长和人们共享数据的需要，各种数据库应用而生，其中，NCBI（national center for biotechnology information）的基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）是世界上最大的储存高通量分子丰度数据的公共数据库，用户可以提交、储存和检索多种形式的数据并免费使用。迄今为止，GEO已收录了300000个样本的数据，涉及16亿个基因表达丰度数据，涵盖500多种生物体，广泛覆盖各种生物学内容。GEO数据库操作简单，数据全面，免费共享的优势为后期数据挖掘和信息推广提供了良好的平台。文章概述了GEO数据库的结构、数据的提交、检索和其在分子生物学领域中的应用前景。登陆GEO数据库的网址为：http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／geo。

细胞遗传学检测在慢性髓性白血病中的临床意义

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂（TKI）时代，慢性髓性白血病（cML）病程演进与细胞遗传学的关系。方法应用骨髓细胞短期培养法，对387例初诊CML患者行染色体G显带技术核型分析，结合ABL激酶区点突变检测分析细胞遗传学变化与CML病程演进的关系。结果间接荧光原位杂交（FISH）技术检测387例CML患者BCR—ABL融合基因阳性，其中Ph’CML占94．1％（364／387），Ph—CML占5．9％（23／387）；标准易位t（9；22）（q34；q11）320例（87．9％），变异易位5例（1．4％），初诊Ph’合并额外染色体异常（ACA）39例（10．7％）。合并ACA中“主要路径”异常22例（56．4％），“次要路径”异常15例（38．5％），-Y异常2例（5．1％）。23．4％（71／303）标准易位患者在TKI治疗中出现ACA，主要为染色体数目异常，此类患者疾病进展比例高（X2=168．21，P〈0．001）、更易合并点突变（x2=29．04，P〈0．001）。初诊CML慢性期合并ACA患者与标准易位患者相比，有较低的无事件生存（EFS）及无病生存（DFS）率（P值分别为0．037和0．003），但总生存（OS）率差异无统计学意义（P=0．209）。CML慢性期患者TKI治疗过程中出现ACA者与无ACA者相比，OS、EFS、DFS率均降低（P值均〈0．001）。进展期合并ACA患者长期生存率下降（P=0．086）。结论CML在病程演进中往往合并ACA，此类患者更易发生不良事件或疾病进展，在TKI治疗过程中规律、及时行染色体核型分析及点突变检测对疗效评估及预后判断具有重要意义。

p16基因缺失在成人Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病中的临床意义

目的探讨p16基因缺失在成人Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph＋ALL）中的临床意义。方法回顾性分析80例Ph＋ALL伴p16基因缺失患者的临床特征、免疫表型、细胞遗传学、分子生物学改变及其预后。结果31．3％Ph＋ALL患者合并p16基因缺失；p16基因缺失组与非缺失组相比，初诊时高白细胞计数（WBC30×10^9／L）更常见，高表达CD20，更易出现附加染色体异常，其中以累及7、8、19号染色体以及der（22）较为常见；两组诱导缓解率比较差异无统计学意义（P=0．033），p16基因缺失组患者治疗3个疗程后获BCR—ABL融合基因主要分子学反应（MMR）率和完全分子学反应（CMR）率均明显低于非缺失组（P值分别为0．034和0．036），且复发率明显高于非缺失组（P=0．033）；p16基因缺失组使用伊马替尼联合化疗者和使用达沙替尼联合化疗者的MMR、CMR率及复发率差异均无统计学意义（P值均〉0．05）；p16基因缺失组患者3年总体生存（OS）率及无病生存（DFS）率分别为37．1％和12．4％，显著低于非缺失组的54．1％和45．9％（P值分别为0．037和0．026）；25例p16基因缺失患者中14例行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），其中位OS时间为21个月，明显长于非移植组患者的12个月（P=0．030）。结论成人Ph’ALL伴p16基因缺失患者预后相对较差，二代酪氨酸激酶抑制剂不能明显改善其疗效，但allo-HSCT能够改善部分患者的生存，明确p16基因缺失状态对于评估预后和指导临床治疗有重要意义。