基于网络药理学探讨新疆桑白皮防龋机制及其对主要致龋菌作用的研究

目的探讨新疆桑白皮防龋潜在机制,并分析其对主要致龋菌的作用。方法TCMSP数据库筛选新疆桑白皮活性成分及靶点。Genecards、DisGENET和TTD数据库获取龋病靶点。获取新疆桑白皮防龋的共同靶点,并筛选核心基因。使用DAVID数据平台进行富集分析。采用AutoDock软件进行分子对接验证。通过体外抑菌实验,首先测定新疆桑白皮提取物对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌的50%最低抑菌浓度(50%minimum inhibitory concentration,MIC50)、最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC),并绘制生长曲线;分别测定新疆桑白皮提取物对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌浮游状态产酸、产糖和黏附能力的影响;通过结晶紫染色法测定新疆桑白皮提取物对主要致龋细菌单菌种50%最低生物膜抑制浓度(50%minimum biofilm inhibition concentration,MBIC50)和50%最低已形成生物膜清除浓度(50%minimum biofilm re-duction concentration,MBRC50),并利用扫描电子显微镜观察生物膜形态。结果筛选出新疆桑白皮防龋关键活性成分包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白细胞介素-6(interleu-kin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β)等可能是新疆桑白皮防龋的关键靶点。富集分析结果显示新疆桑白皮可能对AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等产生影响。抑菌实验结果显示新疆桑白皮提取物对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌的MIC50分别为0.5、0.5、0.25 mg/mL,MBC分别为4.0、2.0、1.0 mg/mL。新疆桑白皮提取物对3种主要致龋细菌浮游状态产酸、产多糖以及黏附能力的抑制作用较对照组强,差异均具有统计学意义(P<0.05)。新疆桑白皮提取物对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌的MBIC50分别为1.0、1.0、0.5 mg/mL,MBRC50分别为4.0、4.0、2.0 mg/mL。扫描电镜结果显示随着新疆桑白皮药物浓度的增加,生物膜形成量与对照组相比逐渐减少。结论新疆桑白皮可通过槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等活性成分,TNF、IL-6、IL-1β等关键靶点及多种作用途径防龋,不仅能抑制主要致龋细菌浮游状态生长、产酸、产糖、黏附能力且对致龋菌生物膜形成有一定的抑制作用。

新疆桑白皮提取物对主要致龋细菌生物膜作用的实验研究

目的探讨新疆桑白皮提取物对主要致龋细菌在生物膜状态下产酸、产糖等致龋毒力因子及生物膜活性的影响。方法制备变异链球菌、血链球菌和黏性放线菌3种单菌种菌悬液,分为阴性对照组[不添加新疆桑白皮提取物或氯己定(CHX)];阳性对照组(添加0.05%CHX);实验组(添加不同浓度新疆桑白皮提取物),测定新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌生物膜状态下产酸能力的影响,通过测定24 h内不同时间节点pH值制作pH曲线。采用蒽酮硫酸法测定新疆桑白皮提取物对水溶性及水不溶性胞外多糖合成水平的影响。分别采用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性试验和钙离子(Ca^(2+))泄漏实验,测定新疆桑白皮提取物对3种致龋菌生物膜上清液中LDH含量和Ca^(2+)浓度的影响;采用活死菌染色实验,测定新疆桑白皮提取物对3种致龋菌生物膜活性的影响。结果与阴性对照组比较,实验组(除1/4MBIC_(50)实验组)和CHX组生物膜ΔpH值均减小,3种致龋细菌单菌种生物膜产IEPS、SEPS能力降低,上清液中LDH含量和Ca^(2+)浓度升高,生物膜细菌总量下降,死细菌数量增大,活/死细菌比值百分比下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与CHX组比较,实验组3种致龋细菌生物膜ΔpH值均增大,生物膜产IEPS、SEPS能力升高,上清液中LDH含量和Ca^(2+)浓度降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论新疆桑白皮对3种致龋细菌生物膜状态下产酸、产糖能力具有一定抑制作用,能够影响破坏3种致龋细菌生物膜的活性。

新疆桑白皮提取物防龋作用的实验研究

目的探究新疆桑白皮提取物防龋作用的有效性及安全性。方法建立大鼠龋齿动物模型,将42只SPF-SD大鼠随机分为6组,分别为新疆桑白皮提取物高、中、低剂量组(1.00、0.50、0.25 g/L的新疆桑白皮提取物)、阳性对照组(0.12%的氯己定,CHX组)、阴性对照组(无菌蒸馏水干预的龋病模型组,CA组)、空白对照组(不干预,Control组),各组连续干预大鼠口腔3周。药物有效性评价:采集大鼠唾液并进行变异链球菌的计数,测定变异链球菌水平;采集大鼠颌骨组织,左侧上下颌骨经0.4%紫脲酸铵染色18 h后,体式显微镜下对鼠磨牙的窝沟及光滑面龋进行Keyes评分,评估龋齿的发展程度;将右侧上下颌骨制成牙磨片,经0.1 mmol/L罗丹明B染色24 h后,使用激光共聚焦显微镜观察鼠磨牙牙磨片的脱矿程度,评估龋齿状况。药物安全性评价:记录实验期间各组大鼠的体重增幅,观察新疆桑白皮提取物对大鼠生长发育的影响;计算脏器系数(脏器重量/大鼠体重×100%),评估新疆桑白皮提取物对大鼠主要脏器的影响;取大鼠同一部位颊黏膜,并对大鼠主要脏器、颊黏膜组织进行HE染色,观察组织结构的改变,评估新疆桑白皮提取物对口腔黏膜的刺激性以及脏器细胞的毒性。结果鼠龄50 d,与CA组比较,新疆桑白皮提取物高、中剂量组S.mutans水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与CA组比较,新疆桑白皮提取物高、中剂量组磨牙光滑面及窝沟处各级龋损Keys评分均降低,新疆桑白皮提取物低剂量组磨牙光滑面、E级、Ds级、Dm级评分均降低,桑白皮高剂量组和CHX组渗透入釉质或牙本质的荧光量降低,新疆桑白皮提取物中剂量及CHX组心脏脏器系数增大,差异有统计学意义(P<0.05)。在实验过程中,各组大鼠健康状况良好,无死亡个体,大鼠体重的生长趋势相似。各组大鼠主要脏器及颊黏膜HE染色切片均匀,组织学结构未见明显改变。结论新疆桑白皮提取物可有效阻止大鼠龋病的发生和进展,对大鼠体重和主要脏器的功能无明显影响,对口腔黏膜无刺激性。