人乳头瘤病毒16型E6/E7基因shRNA真核表达载体构建及其对人宫颈癌SiHa细胞增殖及迁移能力的影响

目的构建针对人乳头瘤病毒16型E6/E7基因的shRNA真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的人宫颈癌SiHa细胞系并探讨其对SiHa细胞增殖及迁移能力的影响。方法合成3条特异性干扰HPV16 E6/E7基因的shRNA片段并定向插入psilencer 2.1-U6 hygro载体,构建重组质粒psilencer 2.1-U6hygro-shE6/E7并转染入人宫颈癌SiHa细胞,Real-time PCR检测转染后细胞E6/E7 mRNA的表达,选择沉默效应最好的重组质粒并用潮霉素B稳筛,获得稳定表达重组质粒的SiHa细胞,并用real timePCR和Western blot方法进行鉴定;分别运用CCK-8细胞增殖实验和细胞划痕愈合实验检测细胞的增殖及迁移能力。结果测序证实针对HPV16 E6/E7的shRNA真核表达载体psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7构建正确;转染psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7的SiHa细胞HPV16 E6/E7表达明显受抑,同时其增殖及迁移能力也明显受抑制。结论 psilencer 2.1-U6 hygro-shE6/E7真核表达载体的成功构建并获得稳定沉默表达HPV16 E6/E7的人宫颈癌SiHa细胞系,证实沉默表达HPV16 E6/E7的SiHa细胞增殖及迁移能力会明显受到抑制,这为进一步研究HPV 16 E6/E7基因在宫颈癌发生发展过程中的功能奠定了实验基础。

Twist介导的衰老逃逸与宫颈癌侵袭转移的关系

目的探究Twist介导的衰老逃逸在宫颈癌侵袭转移过程中的作用。方法免疫组织化学法检测70例宫颈鳞状细胞癌标本中Twist和衰老指标CBX3的表达;合成靶向Twist的小干扰RNA瞬时转染宫颈鳞癌细胞SiHa,免疫细胞化学及β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老变化。结果 Twist在早期宫颈鳞癌（Ⅰa~Ⅱa期）及晚期宫颈鳞癌（Ⅱb~Ⅲb期）组织中表达强阳性率分别为6.7%和15.0%,CBX3表达强阳性率分别为10.0%和0%;而在发生或未发生淋巴结转移的宫颈鳞癌组织中,Twist表达强阳性率分别为25.0%和2.4%,CBX3表达强阳性率分别为0%和7.2%。Twist在早、晚期宫颈鳞癌组织表达改变与CBX3相反。低表达Twist的SiHa中CBX3表达上调,并伴有β-半乳糖苷酶染色增强。结论 Twist在宫颈癌发展过程中表达逐渐升高,其介导的衰老逃逸贯穿宫颈癌侵袭转移的整个过程。

SNIP1在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义

目的：探究Smad核内相关蛋白1（Smad nuclear interacting protein 1,SNIP1）在正常宫颈上皮组织及宫颈鳞状细胞癌（宫颈鳞癌）组织中的表达及其意义。方法：免疫组织化学方法及实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测SNIP1在23例正常宫颈组织（正常宫颈组）、25例早期宫颈鳞癌组织（Ⅰa~Ⅱa期）（早期宫颈鳞癌组）和45例晚期宫颈鳞癌组织（Ⅱb~Ⅲb期）（晚期宫颈鳞癌组）中的表达。结果：免疫组织化学方法显示SNIP1蛋白在正常宫颈组、早期宫颈鳞癌组及晚期宫颈鳞癌组中胞质强阳性表达率分别为0,36.0%和73.3%;胞核强阳性表达率分别为17.4%,44.0%和71.1%,且三组间胞质与胞核的表达差异均具有统计学意义（P〈0.01）。在伴有淋巴结转移的宫颈鳞癌病例中,SNIP1在胞质、胞核中的强阳性率分别高于不伴淋巴结转移病例,且差异有统计学意义（P〈0.001）。Real-time PCR技术检测显示SNIP1 mRNA在正常宫颈组、早期宫颈鳞癌组及晚期宫颈鳞癌组中表达呈递增趋势,除了正常宫颈组与早期宫颈鳞癌组间差异无统计学意义外,其余各组间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：SNIP1可能参与调控宫颈鳞癌的进展及侵袭转移过程的发生,并有望成为宫颈鳞癌侵袭转移情况的预测因子。

阴道发育异常121例临床分析

目的探讨阴道发育异常的临床特征和诊治情况。方法回顾性分析2007年至2014年在我院就诊的121例阴道发育异常患者的临床资料。结果 121例阴道发育异常患者中先天性无阴道42例(34.7%),阴道闭锁36例(29.8%),阴道纵隔33例(27.3%),阴道横隔10例(8.2%)。临床表现主要为无月经来潮(64.5%)、周期性腹痛(51.2%)和性生活困难(47.9%)。其中合并子宫畸形患者80例(66.1%),合并肾脏畸形患者12例(9.9%)。121例阴道发育异常患者中维吾尔族69例(57.0%),汉族29例(24.0%),哈萨克族14例(11.6%),其他民族9例(7.4%)。121例阴道发育异常患者中95例行手术治疗。结论阴道发育异常以先天性无阴道所占比例最大,可伴有子宫发育畸形和泌尿系统畸形,伴发畸形的诊断有重要临床意义。阴道发育异常患者大多需手术治疗,具体术式根据病变类型决定。

宫颈腺癌细胞中HPV18-E7与上皮间质转化的关系研究

目的:探究宫颈腺癌细胞中HPV18-E7与上皮间质化(EMT)之间的关系。方法:针对HPV18-E7的si RNA转染入人宫颈腺癌He La细胞,观察细胞形态变化,并运用Real-time PCR技术、免疫印迹实验和细胞免疫荧光染色实验在m RNA水平和蛋白水平检测E7、EMT相关的标记因子的表达及定位变化;应用细胞划痕愈合实验及Transwell细胞体外侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:特异性沉默HPV18-E7表达后He La-SIE7细胞间连接变得疏松,细胞中E7与间质性标记物的m RNA及蛋白表达水平较对照组细胞显著下降,上皮性标记因子较对照组细胞明显增加(P<0.01);随着He La细胞E7表达的下调,Ecadherin在细胞膜上的表达增加,间质性标记因子在细胞质内的表达随之下降。He La-SIE7细胞迁移及侵袭能力明显低于对照组(P<0.01);沉默HPV18-E7表达的He La细胞其增殖能力也明显减弱。结论:宫颈腺癌细胞中HPV18-E7能够引起EMT,促进肿瘤发生侵袭转移。

HPV18-E7介导的上皮间质转化与抑癌基因Rb的关系研究

目的探究宫颈腺癌细胞中HPV18-E7介导的上皮间质化(EMT)与抑癌基因Rb之间的关系。方法针对HPV18-E7的siR N A转染入人宫颈腺癌HeL a细胞运用R ealtime PCR技术、免疫印迹实验在mRNA水平和蛋白水平检测E7与Rb的表达变化;Real-time PCR技术筛选特异性针对Rb基因的siR NA,并将其转染入HeL a-siE 7细胞运用免疫印记实验检测EMT相关的标记因子的表达变化,CCK-8细胞增殖实验和免疫荧光染色法检测细胞增殖能力及细胞骨架的变化;最后用染色质免疫沉淀和real-time PCR技术检测Rb是否通过作用于E-cadherin基因的启动子区来发挥调控其表达的作用。结果HeL a-siE 7细胞内R b表达较对照组细胞显著上调;HeL a-siE 7-siR b细胞较HeL a-siE 7细胞E-cadherin的表达明显下调,vimentin的表达却显著上调;HeL a-siE 7-siR b细胞增殖能力显著增强;沉默E7表达后细胞失去极性,呈卵圆形,而在沉默E7表达的基础上沉默Rb后,细胞又重新获取细胞极性变回梭形;染色质免疫沉淀实验结果表明抑癌基因Rb可直接作用于上皮性标记因子E-cadherin的启动子区。结论 HPV18-E7能够结合抑癌基因Rb使其失去活性从而致使其无法绑定在上皮标记因子E-cadherin启动子区来调控其表达,最终导致宫颈腺癌发生EMT,促进肿瘤发生侵袭转移。