二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G2／M期检查点Chk1与Chk2的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响。方法流式细胞术检测细胞周期改变;Northern blot、Westernblot与免疫细胞化学检测DADS处理MGC803细胞的Chk1与Chk2表达。结果流式细胞术分析显示,30 mg.L-1DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞在G2/M期(P<0.05);Northern blot检测表明,DADS不同时间作用MGC803细胞后,Chk1与Chk2 mRNA表达与未处理组差异无显著性(P>0.05);免疫细胞化学发现Chk1与Chk2表达与未处理组无明显改变(P>0.05);Western blot DADS在不同时间对MGC803细胞Chk1与Chk2总蛋白表达无改变(P>0.05),而磷酸化的Chk1表达呈时间依赖性增加(P<0.05),但磷酸化的Chk2无明显改变(P>0.05)。结论 DADS阻滞MGC803细胞G2/M期与磷酸化Chk1有关。

Chk1/2转基因MGC803细胞系的建立与鉴定

目的构建Chk1/2基因的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌MGC803细胞,为研究Chk1/2功能奠定基础。方法参照野生型Chk1/2基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序法对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入MGC803细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果菌液特异性PCR结果表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,测序分别证实为Chk1和Chk2基因,经NCBIBLAST分析与Genbank中Chk1基因的同源性为100%,编码的氨基酸同源性为100%,Chk2基因的同源性为99%,编码的氨基酸同源性为100%。G418筛选转染细胞4周后获得稳定转染空载体pcD-NA3.1(+)的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的MGC803细胞。经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在MGC803细胞中的表达比对照组明显增加。结论成功构建Chk1/2基因真核表达载体与Chk1/2高表达MGC803细胞,为研究二烯丙基二硫诱导MGC803细胞G2/M期阻滞的机制奠定了基础。

二烯丙基二硫诱导肿瘤细胞G_2/M期阻滞的分子机制

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、胃癌、白血病等许多肿瘤均有明显的抑制作用,其作用与G2/M期阻滞有关。DADS阻滞G2/M期的分子机制包括抑制p34cdc2的活性,激活MAPK信号通路,增加p21WAF1/cip1蛋白表达与ROS生成等。

RNA干扰Chk1/2调控二烯丙基二硫诱导的G2/M期阻滞作用及相关周期蛋白表达

在细胞周期检测点信号传导通路中,Chkl和Chk2起着重要作用,主要参与G2/M期细胞周期检测点信号传导.首先采用RNAi技术在BGC823细胞中将Chk1、Chk2基因沉默,Chk1、Chk2 siRNA转染BGC823细胞后24h加入15mg/L二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS),接着通过Real-timePCR、Western blot分析Chk1、Chk2基因在转染前后的表达差异,然后运用流式细胞术和Western blot分析Chk1、Chk2基因沉默后对DADS诱导的细胞周期G2/M期阻滞作用及相关周期蛋白CDC25C和cyclinB1表达的影响.实验结果表明,与未转染对照组相比,转染Chk1、Chk2siRNA后BGC823细胞中Chk1、Chk2表达明显被抑制,二者的mRNA表达分别下降84.7%和69.0%,蛋白质水平分别下降73.4%和78.5%.流式细胞术分析结果发现,ChklsiRNA转染的BGC823细胞在15mg/LDADS处理24h后,G2/M期比例由单纯DADS处理组的58.1%降至10.4%(P<0.05).但Chk2 siRNA转染后加入15mg/LDADS,与单独15mg/LDADS作用相比,细胞周期G2/M期比例差异不明显(P>0.05).Chk1和Chk2下游分子的改变显示,DADS可抑制BGC823细胞中CDC25C和cyclinB1表达(P<0.05),但Chk1基因沉默后加入DADS,CDC25C和cyclinB1表达却不被抑制(P>0.05),Chk2基因沉默后对DADS抑制CDC25C和cyclinB1表达的作用无影响.由此得出结论,Chkl基因沉默可消除DADS诱导BGC823细胞G2/M期阻滞作用,DADS阻滞G2/M期可能是通过Chk1/CDC25C/cyclinB1信号通路起作用.

DADS对Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞G_2/M期的影响

目的在建立Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞基础上,探讨DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞G_2/M期的作用。方法分别采用集落形成实验、流式细胞术、RTPCR、Western blot等方法,检测DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞增殖、细胞周期分布、Chk1与Chk2 mRNA与蛋白、p-Chk1与p-Chk2及CDC25C与cyclinB1的表达。结果软琼脂集落形成实验显示,30 mg·L^(-1)DADS作用Chk1与Chk2高表达MGC803细胞组集落形成率均明显低于对照组与空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,30 mg·L^(-1)DADS作用12、24、36、48 h后,Chk1/MGC803细胞G_2/M期分别为41.3%、57.4%、68.9%、42.9%,较MGC803细胞与Chk2/MGC803细胞明显增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803细胞与MGC803细胞差异没有显著性(P>0.05)。RT-PCR显示,Chk1/MGC803与Chk2/MGC803细胞Chk1与Chk2mRNA水平较对照组无明显变化;并且,Western blot显示,Chk1与Chk2总蛋白及p-Chk2的表达无明显改变,但pChk1呈时间依赖性上调,CDC25C与cyclinB1呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论 DADS可阻滞Chk1/MGC803细胞于G_2/M期,与上调磷酸化Chk1和下调CDC25C与cyclinB1有关。

DADS诱导人胃癌细胞周期阻滞相关基因的差异表达

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞相关基因表达的变化。方法MTT法、流式细胞术分别分析DADS对MGC803细胞的抑制作用与细胞周期分布的影响;功能基因芯片检测周期相关差异表达基因;Western blot、RT-PCR验证周期相关基因的表达。结果MTT法、流式细胞术证明DADS可明显抑制MGC803细胞增殖并诱导G2/M期阻滞。基因芯片结果显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞4 h后,表达上调的基因有CDC45L、CDK5R1、p21、CUL4A、GADD45α、RAD17、TP53,下调的基因是ANAPC5、ATR、BRCA1、CCNA2、CCNB2、CCNE1、CCNE2、CDC16、CDC6、CDK5RAP1、GTF2H1、MCM5、RAD9A、RGC32。RT-PCR显示30 mg.L-1DADS处理MGC803细胞4、8、12 h后,p21、GADD45α时间依赖性的表达增强(P<0.05),CyclinB1呈时间依赖性的表达降低(P<0.05)。TP53在4、8、12 h后与对照组比较表达明显增强(P<0.05)。Western blot结果表明,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24 h后,p53、GADD45α、p21蛋白表达上调,CyclinB1蛋白表达下调(P<0.01)。结论DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M周期阻滞是由多基因协同作用的结果,可能通过两种途径共同调节完成的。

二烯丙基二硫化物对人胃癌MGC803细胞G_2/M期检查点激酶Chk1/2的影响

目的:观察二烯丙基二硫化物(DADS)对人胃癌MGC803细胞的细胞周期检查点激酶1(Chkl)和细胞周期检查点激酶2(Chk2)的影响。方法:RT-PCR检测MGC803细胞的Chk1和Chk2激酶在mRNA水平的改变;Western blotting检测Chk1、Chk2的表达和Chk1、Chk2的磷酸化程度,免疫共沉淀检测Chk1、Chk2与细胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)结合情况。结果:RT-PCR检测显示,Chkl和Chk2 mRNA水平在处理组与未处理组之间无明显差异(P>0.05)。Western blotting检测显示,MGC803细胞分别受30 mg.L-1DADS刺激1 h和2 h后,与未处理组相比,总Chk1和Chk2蛋白表达在细胞处理前后均无明显改变(P>0.05);但处理组细胞Chk1磷酸化程度明显增加,并呈时间依赖性(P<0.01),而Chk2在处理组与未处理组间磷酸化程度无明显差异(P>0.05)。免疫共沉淀分析表明,MGC803细胞中DADS能促进Chk1与Cdc25C结合,而对Chk2与Cdc25C结合无影响。结论:DADS可能是通过激活Chk1引起人胃癌MGC803细胞G2/M期阻滞。

MCL1蛋白在胃癌中的表达及临床意义

目的:MCL1(myeloid cell leukemia-1)与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移相关。本文从临床样本和细胞水平检测胃癌组织中MCL1蛋白的表达水平,探讨MCL1蛋白在胃癌发生、发展中的作用。方法:采用S-P免疫组化法检测正常胃黏膜、癌旁胃黏膜和胃癌组织芯片中MCL1蛋白的表达,Western blot检测MCL1蛋白在人胃癌BGC823、SGC7901、MKN28细胞中的表达。结果:免疫组化结果显示,MCL1蛋白表达定位于细胞的胞浆,着色呈黄色至棕黄色;正常胃黏膜、癌旁胃黏膜、胃癌中MCL1蛋白阳性表达率分别为18.18%(4/22)、54.17%(26/48)、83.33%(75/90);MCL1蛋白在胃癌中的表达高于癌旁胃黏膜及正常胃粘膜,癌旁胃黏膜与正常胃粘膜MCL1蛋白表达亦具有明显差异(P<0.05);MCL1蛋白阳性表达率在伴淋巴结转移组为93.48%(43/46),无淋巴结转移组为72.72%(32/44),两者差异有显著性意义(P<0.05);而与性别、年龄和肿瘤大小无关。S-P免疫组化法与Western blot结果显示MCL1蛋白表达与胃癌分化程度呈负相关。结论:MCL1蛋白表达与胃癌发生、分化程度和淋巴结转移相关。

敲低乳酸脱氢酶A抑制人乳腺癌细胞生长与侵袭

目的:探讨乳酸脱氢酶A(LDHA)在人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学功能。方法:qRT-PCR检测人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和HCC38)与人正常乳腺细胞系(MCF-10A)中LDHA的表达水平。运用MTT实验方法检测si-LDHA对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长能力的作用。Transwell侵袭实验检测si-LDHA对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭作用。结果:qRT-PCR检测结果显示,人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和HCC38)中LDHA的表达水平显著高于人正常乳腺细胞系(MCF-10A)的表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。MTT检测发现,干扰LDHA可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验显示,干扰LDHA可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:干扰LDHA可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长与侵袭。

敲低程序性死亡配体1抑制人乳腺癌细胞生长与转移

目的分析程序性死亡配体1(PDL1)在人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学功能。方法 qRTPCR检测人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和HCC38)与人正常乳腺细胞系(MCF-10A)中PDL1的表达水平;运用MTT实验检测si-PDL1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长能力的作用;划痕实验检测si-PDL1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力的作用;Transwell侵袭实验检测si-PDL1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭作用。结果 qRT-PCR检测结果显示,人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和HCC38)中PDL1的表达水平明显高于人正常乳腺细胞系(MCF-10A)的表达水平(P <0.01);MTT检测发现,干扰PDL1可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长(P <0.05);划痕实验检测发现,干扰PDL1可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力(P <0.05);Transwell侵袭实验显示,干扰PDL1可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭(P <0.05)。结论干扰PDL1可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长与迁移侵袭。

外源高表达miR-133b抑制骨肉瘤的增殖与转移

目的分析miR-133b对骨肉瘤细胞增殖与转移的影响。方法q RT-PCR检测人骨肉瘤细胞系(MG-63)与人正常成骨细胞系(h FOB)中miR-133b的表达水平;运用MTT实验检测miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞的生长能力的作用;运用划痕实验检测miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞的迁移能力的作用;Transwell侵袭实验检测miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力作用。结果qRT-PCR检测结果显示,MG-63细胞中miR-133b的表达水平明显低于h FOB细胞的表达水平(P<0.01);MTT检测发现,外源高表达miR-133b可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的生长(P<0.01);划痕实验检测发现,外源高表达miR-133b可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的迁移能力(P<0.01);Transwell侵袭实验显示,外源高表达miR-133b可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力(P<0.01)。结论外源高表达miR-133b可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖与转移。

外源高表达miR-133b抑制骨肉瘤的生长与诱导凋亡

目的:探讨miR-133b对骨肉瘤细胞生长与凋亡的影响。方法:运用MTT实验检测miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞生长能力的作用。凋亡实验检测miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡作用。结果:MTT实验检测发现,外源高表达miR-133b可抑制人骨肉瘤MG-63细胞生长,差异有统计学意义(P<0.05)。凋亡实验显示,外源高表达miR-133b可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:外源高表达miR-133b可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的生长与诱导凋亡。

创新骨干护士培训模式在临床高年资护士培训中的应用思路分析

分析创新骨干护士培训模式在临床高年资护士培训中的应用思路。方法:本次研究时间选择在2021年09月-2021年11月展开,选取临床高年资护士(护龄≥6年)共30名为研究对象,所有护士均行创新骨干护士培训模式12周。结果:高年资护士接受创新骨干护士培训模式后临床综合能力考核成绩、护理关怀行为、职业获益感、岗位胜任力、工作压力改善情况均明显高于培训前(P<0.05)。结论:在临床高年资护士培训中采用创新骨干护士培训模式效果显著。