分子识别理论在促甲状腺激素受体系统的应用

目的观察促甲状腺激素受体(TSHR)分子上的特定片段-TR1(aa37-45)、TR2(aa353-366)和TR3(aa648-655)与其相应的反义肽-RT1(aa45-37)、RT2(aa366-353)和RT3(aa655-648)之间的选择性识别。方法制备固相反义肽亲和层析柱-RT1-sepharose4B,RT2-sepharose4B和RT3-sepharose4B,采用阶段洗脱法,观察相应天然肽-TR1、TR2和TR3在柱上的滞留行为。结果TR1、TR2和TR3与其相应的反义肽之间存在选择性识别,而反义肽RT1且能识别TSHR大分子;此外,牛促甲状腺激素(bTSH)蛋白还能被TR1识别。结论本实验证实了分子识别理论在促甲状腺激素受体系统的存在,它可能用于生物大分子蛋白质的分离、促甲状腺激素(TSH)与受体(TSHR)结合位点的测定,并用于实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的实验性治疗。

灵敏的甲状腺微粒体抗体酶联免疫吸附分析的建立

甲状腺微粒体抗体（ＴＭＡｂ）或称甲状腺过氧化物酶抗体（ＴＰＯ－Ａｂ）已广泛用于人类甲状腺自身免疫性疾病的诊断，但粗提的人甲状腺微粒体制备物含有残留的甲状腺球蛋白（ＴＧ）和其它膜抗原，影响方法的灵敏度，我们采用亲和层析的方法，得到纯度较高的ＴＭ抗原，建立了灵敏的ＴＭＡｂ－ＥＬＩＳＡ。该方法的批内变异系数为３．２±０．０１％（ｎ＝８０），批间变异系数为８．３±０．０２％（ｎ＝８）；临床甲亢病人的阳性率为８０．０％（ｎ＝４６），与国内同类放免试剂盒相比，对Ｇｒａｖｅｓ病的阳性检出率提高２０％（ｎ＝２０），桥本氏甲状腺炎的阳性检出率提高１１．７％（ｎ＝２６）。

反义肽研究进展

介绍反义肽的概念及其结合特性，并对其作用机理以及在生物技术上的应用前景进行了探讨。

促甲状腺激素受体多肽片段aa352-366的特性

目的观察促甲状腺激素受体(TSHR)活性片段aa352-366的免疫调节作用,探讨TSHR分子结构与功能的关系。方法将血蓝蛋白(KLH)偶联的多肽KLH-TSHRaa352-366和多肽加受体的混合物KLH-TSHRaa352-366+gTSHR,间隔15d分两组分别注入BALB/c小鼠腹腔内,对照组注射生理盐水,测定各时相血清中总三碘甲状腺氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)、促甲状腺激素受体刺激抗体(TSAb)、促甲状腺激素受体抑制抗体(TBAb)水平;第90天后处死动物,检测小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平及其病理变化。结果与各组自身0d的数据比较,多肽组小鼠血清TT3、TT4水平降低,TRAb升高;多肽加受体组TT3、TT4水平降低,TRAb和TBAb升高,而TSAb降低。此外,多肽加受体组甲状腺组织TSHRmRNA水平较正常组增高;多肽组小鼠甲状腺组织显示滤泡上皮细胞扁平、核缺失、皱缩及胶质浓缩等甲状腺功能减低的病理改变。结论hTSHRaa352-366刺激小鼠血清TRAb和TBAb的产生,阻断TSH与TSHR的结合,抑制三碘甲状腺氨酸(T3)、甲状腺素(T4)的分泌,引起甲状腺组织的病理改变,可能是TBAb在TSHR大分子上的抗原决定簇。

TSHR大分子及其活性多肽在BALB/c小鼠体内的免疫原特性研究

目的:观察促甲状腺激素受体(TSHR)及其活性片段aa352-366在BALB/c小鼠体内的免疫原特性研究,探讨TSHR分子结构与功能的关系。方法:将血蓝蛋白(KLH)偶联的多肽TSHRaa352-366-KLH和多肽加受体混合组-TSHRaa352-366-KLH加豚鼠TSHR(gTSHR),间隔15d分两组分别注入BALB/c小鼠腹腔内,对照组注射KLH,测定各时相血清中甲状腺激素及促甲状腺激素受体抗体水平;90d后处死动物,检测小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平及其病理变化。结果:与各组自身0d的数据比较,多肽组小鼠血清TT3、TT4水平降低(P<0·01),TRAb升高(P<0·01);多肽加受体混合组TT3、TT4水平降低(P<0·01),TRAb(P<0·01)、TBAb(P<0·05)和TSAb(P<0·05)均升高。此外,混合组甲状腺组织TSHR mRNA水平明显高于正常组(P<0·05);多肽组小鼠甲状腺组织显示滤泡上皮细胞扁平、核缺失、皱缩及胶质浓缩等甲减的病理改变,而混合组则呈现不均一的病理变化。结论:TSHR以及活性片段hTSHRaa352-366都具有免疫原性,刺激小鼠血清TRAb、TSAb和TBAb的产生,引起甲状腺组织的病理改变。

hTSHR膜外区氨基端基因原核表达载体的构建和鉴定

目的:为研究人促甲状腺素受体膜外区氨基端(hTSHR462bp)肽段的免疫学特性,将hTSHR462bpcDNA片段在原核表达系统中表达,故构建原核表达载体。方法:以人Graves病患者甲状腺组织中提取mRNA为模板,利用RT-PCR方法扩增双链甲状腺组织cDNA,又以PCR技术扩增目的基因,定向克隆法构建融合基因的原核表达载体pET102-hTSHR462bp。结果:获得了重组目的基因原核表达载体并经PCR鉴定、酶切鉴定插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符。结论:成功构建了融合基因的原核表达载体pET102-hTSHR462bp,为进一步的蛋白表达、其生物学功能研究和未来临床应用奠定了基础。

pcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建

目的:构建重组体pcDNA3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa。该片段与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确。结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcDNA3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达。

人促甲状腺激素受体抗原决定簇的研究进展

在环境和遗传因素基础上,机体免疫功能异常变化导致自身免疫性甲状腺疾病,促甲状腺激素受体抗体是其重要的自身抗体,它们属于异质性抗体,不同抗体诱发不同病理改变,每种抗体的相应抗原决定簇在促甲状腺激素受体上分布不尽相同,所致临床表现也迥然不同。确定不同抗体的相应抗原决定簇不仅有助于探讨其病理机制还具有临床诊治意义。

hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达

目的：构建人类促甲状腺激素受体（hTSHR）胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf（aa29-100）、hTSHRe（aa101-278）的真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hT-SHRe,并在CHO细胞中进行表达。方法：RT-PCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1（D）/V5-His-TOPO中,经酶切、PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达,RT-PCR扩增转染细胞的cDNA、Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达。结果：RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株,所得片段大小与预期一致,经Western blot鉴定,相对分子质量（Mr）分别为11900、23600左右,与预期的大小相符。结论：真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe构建成功,RT-PCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达,为进一步研究pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe在体内的基因表达,建立Graves＇病的动物模型奠定了基础。

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。

外标准法实时定量反转录-聚合酶链反应方法的建立

目的为了检测BALB/C小鼠甲状腺促甲状腺激素受体(TSHR)表达,建立外标准法实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法。方法取正常BALB/C小鼠甲状腺提取甲状腺总RNA,逆转录后进行PCR,PCR产物经回收纯化后作为real-timePCR的标准品,制作标准曲线,优化反应条件使溶解曲线有特异扩增。检测豚鼠TSHR分子免疫的BALB/C小鼠甲状腺TSHRmRNA的表达。结果建立的外标准法SYBRGREENⅠ实时定量RT-PCR方法可以灵敏检测到10copies的核酸,灵敏度为普通PCR的104倍;溶解曲线只有特异峰;不同标准点批间变异系数范围为5.8%￣14.3%(n=6)。与对照组比较,TSHR大分子免疫的BALB/C小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平显著升高(P<0.05)。结论外标准法实时定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,可精确地检测出小鼠甲状腺组织TSHRmRNA的水平。

实时定量RT-PCR方法检测豚鼠TSHR免疫BALB/c小鼠甲状腺TSHR的表达

目的:建立外标准法SYBRGREENI实时定量(real-time)RT-PCR方法,以检测豚鼠TSHR分子免疫对BALB/c小鼠甲状腺TSHRmRNA的表达的影响。方法:取正常BALB/c小鼠甲状腺提取甲状腺总RNA,逆转录后进行PCR,得到333bp扩增产物。经回收纯化后作为real-timePCR的标准品,稀释为106、105、104、103、102、101拷贝,制作标准曲线;并同时进行普通PCR,比较其灵敏度。优化反应条件使溶解曲线有特异扩增。检测豚鼠TSHR分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺TSHRmRNA的表达。结果:建立的外标准法SYBRGREENI实时定量RT-PCR方法可以灵敏的检测到10copy的核酸,灵敏度为普通PCR的104倍;溶解曲线只有特异峰,溶解温度为82.9℃。没有明显的引物二聚体和非特异峰出现。不同标准点批间变异系数范围为5.8%￣14.3%(n=6)。与对照组比较,TSHR大分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平显著升高(P<0.05)。结论:外标准法SYBRGREENI实时定量RT-PCR具有灵敏度高,特异性强,重复性好的特点,比普通PCR更精确地检测出小鼠甲状腺组织TSHRmRNA的水平。

甲状腺自身免疫性疾病——细胞自杀的一种表现

自身免疫性疾病，如桥本甲状腺炎、糖尿病、类风湿性关节炎等，目前认为是由于免疫系统失调而攻击自身组织引起的。然而，究竟是免疫系统中哪几种类型的杀伤细胞实施攻击？另一个谜是既然由Ｋ细胞实施免疫攻击，为什么在自身免疫疾病组织损伤部位却罕见Ｋ细胞的存在？Ｇｉ...

应用催产素反义肽识别催产素体复合物

应用催产素反义肽识别催产素体复合物陆凤先王伟汤特应用催产素反义肽识别催产素体复合物@陆凤先@王伟@汤特...

卡贝缩宫素联合一次性宫腔压迫球囊治疗产后出血的作用

研究一次性宫腔压迫球囊、卡贝缩宫素联合治疗方案应用于产后出血中的效果。方法 共纳入40例广西来宾市妇幼保健院收治的产后出血患者(病例选取起止时间2021-01至2022-12)作为研究对象,采用 RandA1.0软件对患者进行分组,将患者分成两个组别:对照组(20例,用纱布充填加卡贝缩宫素),对照组(20例,用一次性气囊加压加卡贝缩宫素),观察两种方法的疗效。结果 与对照组比较,术后2 h和2 h出血明显少于对照组(P<0.05);结果 对照组止血时间明显缩短,月经复潮时间明显缩短,填塞材料留置时间明显缩短(P<0.05);用药前,两组凝血功能指标相似(P>0.05),用药24小时后,两组指标均明显改善,而组间比较并无明显差异(P<0.05);较参照组,治疗组产后出现腹痛、子宫复旧不良、月经量减少、感染等不良反应发生率更低(P<0.05)。结论 一次性宫腔压迫球囊、卡贝缩宫素联合治疗方案更快速止血,减少产后出血量,改善凝血功能,减少不良反应。

催产素与其反义肽抗体的相似性

观察了催产素反义肽抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｏｘｙｔｏｃｉｎ，简称ＡＳ－ ＯＴ－Ａｂ）对催产素受体（ＯＴＲ）的识别特性。该反义肽是按照牛催产素（ＯＴ）和它的结合蛋白ＮｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎＩ（ＮＰＩ）氨基端前十二个氨基酸（包括ＯＴ［１－９］）编码ＤＮＡ的互补序列固相合成的，简称ＡＳ－ＯＴ。ＡＳ－ＯＴ与甲状腺球蛋白联结后，制备兔抗ＡＳ－ＯＴ多克隆抗体（ＡＳ－ＯＴ－Ａｂ），间接酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）证明，ＡＳ－ＯＴ－Ａｂ能与催产素受体（ＯＴＲ）相互结合，而这一结合能被ＯＴ所阻断，显示了ＯＴ与其反义肽抗体的相似性。

TSH受体活性片段反义肽的免疫调节作用

目的通过观察TSH受体(TSHR)活性片段及其反义肽(RHST)对大鼠免疫活性的影响,探讨反义肽的免疫调节作用。方法TSHR片段TR1、TR2、TR3及相应的反义肽RT1、RT2、RT3,或3对互补肽被分别注入不同组大鼠体内,观察免疫前后各组大鼠血清中TT3、TT4、TSH受体抗体(TRAb)、甲状腺刺激型抗体、甲状腺刺激抑制型抗体和TSH抗体(TSHAb)等指标以及甲状腺组织的病理变化。结果3条TSHR片段均刺激TRAb的产生;RT1和RT2可同时诱导出TRAb和TSHAb;TR2引发的甲状腺上皮细胞增生和淋巴细胞浸润可因RT2的注入而缓解。结论实验证明,3条TSHR片段均具有免疫源性;RT1和RT2具有免疫调节作用,可能是TSHR片段的独特型;反义肽可减轻由天然肽引发的体液和细胞免疫,证明了反义肽通过免疫网络进行免疫调节的可能性。