分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究

目的建立分子信标荧光定量PCR检测结核分技杆菌的最佳反应体系，探讨影响分子信标荧光定量PCR扩增结果的多个因素。方法利用单因素法和正交实验法，从MgCl2，引物，分子信标探针，dNTP，Taq DNA聚合酶5种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系进行优化，并对这两种方法所得的最优体系进行比较。结果单因素法得到的最优反应体系（25μl）为：4mmol／L MgCl2，上、下游引物各0．3μmol／L，分子信标探针0．1μmol／L，200μmol／L dNTP，2U Taq DNA；正交法得到的最优反应体系（25μl）为：6mmol／L MgCl2，上、下游引物各0．2μmol／L，分子信标探针0．1μmol／L，100μmol／L dNTP，3U Taq DNA聚合酶，正交法得到的最优反应体系的荧光定量PCR扩增曲线形状更好，Q值较小，△Rn较大。结论采用正交法得到的荧光定量PCR反应体系优于单因素法，进行实时荧光定量PCR反应体系优化时，正交实验设计是一条科学、可靠、高效、快捷的途径。

心绞痛患者血清缺血修饰清蛋白水平的变化及其临床意义

目的观察心绞痛患者血清缺血修饰清蛋白（isehemia modified albumin，IMA）浓度的改变并探讨其临床意义。方法观察对象88例分为三组：不稳定性心绞痛组34例，稳定性心绞痛组24例，正常对照组30例。用全自动生化分析仪法测定血清IMA并行超声心动图检查评价室壁运动和心功能。结果①不稳定性心绞痛患者的血清IMA水平（77．8±11．7 ABSU／ml）明显高于稳定性心绞痛（64．1±7．6 ABSU／m1）和对照组（63．6士6．8ABSU／m1）（P〈0．01）；而稳定性心绞痛的患者与对照组之间无统计学差异（P〉0．05）。②在不稳定性心绞痛的患者中，左室射血分数（LVEF）与血清IMA水平呈明显负相关（r=-0．686，P〈0．001）；LVEF减低（LVEF〈50％）的不稳定性心绞痛患者血清IMA水平（92．1±6．3 ABSU／ml）明显高于LVEF正常（LVEF≥50％）（72．6±8．5 ABSU／ml）的患者（P〈0．01）。结论血清IMA浓度在不稳定性心绞痛的患者中明显升高，且升高水平与LVEF异常有一定的相关性。

酶联免疫一步法检测HBeAg假阴性现象初步探讨

本文对１５４例酶联免疫一步法检测ＨＢｅＡｇ结果为阴性的乙型肝血清标本重新采用经典二步法测定其ＨＢｅＡｇ，结果其中３２份标本的ＨＢｅＡｇ呈阳性。提示使用一步法检测时，会产生假阴性现象。

分子信标荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用

目的建立结核分枝杆菌的分子信标荧光定量PCR检测方法,探讨该方法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法针对结核分枝杆菌Ag85BDNA特异保守序列设计引物和分子信标探针,并构建标准品。采用分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法、集菌培养法检测158例肺结核患者痰液标本,比较3种方法的检出率。结果所建立方法最低检测限度为2个基因拷贝/反应,在2×102～2×108基因拷贝/mL范围内,Ct值同DNA量的对数呈线性关系。该方法检测5株非分枝杆菌和6株非结核分枝杆菌结果均为阴性,检测结核分枝杆菌H37Rv出现75 bp特异条带。分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法、集菌培养法阳性检出率分别为60.13%、16.46%、31.01%,荧光定量PCR法检出率明显高于抗酸染色法和集菌培养法。结论分子信标荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异度,对结核病的诊断有一定的临床意义。

健康人肠道大肠埃希菌耐药性调查与分析

目的:研究健康人肠道大肠埃希菌的耐药性。方法:按有关文献提供的方法分离鉴定健康人肠道大肠埃希菌,K-B法测定150株大肠埃希菌对16种抗生素的敏感性。结果:165份健康人肛拭子分离到150株大肠埃希菌;150株试验菌对6种抗生素的耐药率超过35.00%,对四环素、萘啶酸、磺胺甲基异噁唑、氨苄西林、复方新诺明和链霉素6种抗生素的耐药率分别为63.33%、49.33%、40.67%、38.67%、35.33%,全部菌株对头孢美唑、阿米卡星敏感,122株(81.33%)对一种以上抗生素耐药,对2种以上抗生素耐药的菌株为88株(58.67%),44株(29.33%)对5种以上抗生素耐药,有2株对10种抗生素耐药。结论:健康人肠道大肠埃希菌耐药情况较严重。

细菌鉴定仪在细菌性食物中毒检测中的应用

目的探讨细菌性食物中毒检测流程结合细菌鉴定仪,在细菌性食物中毒中病原菌检测时的应用,供细菌性食物中毒检测参考。方法将采集到的食物中毒标本按细菌性食物中毒检测流程进行检测,获得纯菌落,用细菌鉴定仪进行鉴定。结果应用该方法对11起食物中毒标本进行分离鉴定,7起检出致病菌,检出率为63.6%。结论应用该检测流程和细菌鉴定仪,对细菌性食物中毒病原菌的检测具有快速、准确、全面、自动化程度高的优点。

昆山地区社区卫生服务中心与乡镇医院检验设备的配置现状调查

目的调查江苏省昆山地区社区卫生服务中心与乡镇医院检验设备的配置现状,为进一步探讨小康型乡镇医院检验设备配置标准提供基线数据。方法根据国家关于乡镇卫生院医疗设备配置指导意见设计调查问卷,于2011年8月—2012年2月调查了昆山地区5家市区内社区卫生服务中心,6家中心型乡镇医院和3家一般型乡镇卫生院(乡镇医院)检验设备的配置、运行及维护情况。结果各社区卫生服中心与乡镇医院均配备了全自动生化分析仪、全自动血细胞分析仪、电解质分析仪和尿液分析仪。社区卫生服务中心未配备血气分析仪、血流变仪、酶标仪、洗板机和尿沉渣分析仪;乡镇医院仅未配备血流变仪。社区卫生服务中心配备的30台检验设备中运行良好23台、有缺陷但尚可运行5台、报废2台,乡镇医院90台检验设备中运行良好74台、有缺陷但尚可运行15台、报废1台,差异无统计学意义(χ2=2.849,P>0.05)。社区卫生服务中心的检验设备27台由供应商维护,支付维修费;1台由供应商维护,不支付维修费;乡镇医院分别为87台和2台,差异无统计学意义(χ2=0.149,P>0.05)。社区卫生服务中心28台检验设备中7台进行预防性维护,预防性维护率为25%;乡镇医院89台检验设备全部进行预防性维护,预防性维护率为100%,差异有统计学意义(χ2=80.278,P<0.05)。结论昆山地区乡镇医院检验设备的配置和预防性维护率较社区卫生服务中心好,社区卫生中心在此方面需进一步规范和改进。建议基层医疗机构考虑小型化、便携化、自动化、智能化、标准化的简单微创的用于即时检验的检测设备,配置时应兼顾市场规律和实际需要。

凝胶微柱法与试管法检测放散液中抗体的比较

目的比较凝胶微柱法和试管法检测红细胞释放液抗体的能力。方法将30例外周血和41例脐血红细胞用两种方法测定直接抗人球蛋白试验(DAT)并进行酸放散,将放散液与三种谱细胞、A1、B细胞反应检测抗体的特异性。71例中12例作为阴性对照样本(DAT均为阴性),其中6例为健康献血者外周血,6例为不发生新生儿溶血病(Heamolytic disease of thenewborn,HDN)的婴儿脐血样本。结果24例外周血放散液中有10例两种方法均阳性,12例均为阴性,2例自身免疫性溶血性贫血(AIHA)患者样本凝胶微柱法阳性而试管凝集法阴性,6例健康捐献者的样本DAT试验阴性且两种方法检测放散液均为阴性;41例脐血样本中33例放散液两种方法均反应,2例放散液在试管法中与A1和B细胞反应而同样的放散液做凝胶微柱法时一个和A1细胞反应,另一个只与B细胞反应。结论两种方法检测放散液结果基本是一致的,检测AIHA患者红细胞释放液抗体时用微柱法比较好,检测脐血细胞释放的同种血凝素时试管凝集法更好—些。

人B细胞激活因子受体-TACI基因表达水平定量标准品的构建

目的建立一种简便快速TACI基因表达水平定量标准品的制备方法。方法PCR扩增目的片段,与T载体连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行测序证实,质粒用核酸分析仪准确定量,进行10倍系列稀释,作为标准品。结果:标准品建立的标准曲线有较大的线性范围,批内和批间重复性也较好,且可长期稳定保存。结论:使用质粒标准品对样本中TACI基因表达水平测定是一种可行的办法。

透射比浊法检测免疫球蛋白的结果评价

目的对透射比浊法检测免疫球蛋白结果进行评价。方法根据NCCLS EP9-A文件要求,收集40例临床血清标本,分别用Immage特定蛋白仪(使用配套原装散射比浊试剂)和C8000全自动生化分析仪(使用配套原装透射比浊试剂)检测特定蛋白IgA、IgG、IgM,评价两方法检测结果的一致性结果和结论透射比浊法结果重复性好,与散射比浊法比较相关性良好,可以用于临床检测。

EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的将叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法。方法以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化。结果不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的最大EMA浓度为10μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的最小EMA浓度为0.5μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1%的活菌。结论 EMA-PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景。

EMA-PCR方法快速检测铜绿假单胞菌活菌研究

目的探讨将叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)选择渗透性与PCR技术相结合(EMA-PCR),建立有效快速检测铜绿假单胞菌活菌的方法。方法以铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,检测PCR灵敏度、EMA使用浓度和曝光时间优化试验。结果 PCR检测灵敏度为3×103 CFU/mL;曝光处理时间为10 min;EMA浓度≤5μg/mL对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1μg/mL EMA能有效抑制3×106 CFU/mL死菌扩增;1%活菌混合体系检测结果阳性。结论 EMA-PCR方法能有效快速检测铜绿假单胞菌活菌,能避免PCR检测可能造成的假阳性结果。

微波辅助-液相色谱-原子荧光光谱法对水产品中汞的形态分析

目的建立微波辅助-液相色谱-原子荧光光谱联用分析方法(HPLC-AFS)测定水产品中的无机汞、甲基汞、乙基汞、二苯基汞,并且研究了水产品的样品前处理方法。方法样品经提取液6 mol/L盐酸+0.10 mol/L氯化钠+0.2%L-半胱氨酸5 ml微波萃取后,调节p H值,提取液净化后,注入HPLC-AFS分析。结果无机汞、甲基汞、乙基汞的浓度为0.5μg/L^100μg/L时,线性关系良好,相关系数(r)均为0.999 9,检出限分别为2.08μg/kg、1.41μg/kg、1.36μg/kg。二苯基汞在盐酸介质中发生了分解。方法的日内精密度为3.65%,日间精密度为5.14%。采用BCR-463金枪鱼、GBW10024扇贝、GBW08573黄鱼标准物质对测定方法的准确度进行验证,结果都在给定的参考值范围内。结论本方法操作简便、快速、灵敏、准确,可满足鲜活水产中无机汞、甲基汞、乙基汞的测定,不适用样品中二苯基汞的提取检测。

EMA-PCR技术检测金黄色葡萄球菌活菌

目的将叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相结合,建立一种快速、有效检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。方法用EMA处理金葡菌培养物后提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因(nuc基因)为靶基因进行PCR反应,并对EMA浓度和曝光时间等条件进行优化。结果当检测2×106CFU/ml的金黄色葡萄球菌时,能有效抑制死菌DNA扩增的EMA最小浓度为0.3μg/ml,对活菌DNA扩增没有明显抑制的EMA最大浓度为2μg/ml;经EMA处理后,从含有1%金黄色葡萄球菌活菌混合悬液制备的DNA中可扩增出目的片段。结论 EMA-PCR能有效检测金黄色葡萄球菌活菌,在临床医学和公共卫生领域检测中具有重要的实用价值。

直接测汞法快速检测鸡肉中的总汞

目的建立直接测汞法快速检测鸡肉中总汞的方法。方法样品无需任何前处理即可进入直接测汞仪,经优化干燥、分解,选用合适的汞齐化温度和时间快速测定鸡肉中汞含量。结果采用本方法测定,汞浓度与吸光度在0 ng^20 ng和50 ng^400 ng范围内具有良好的线性关系,相关系数均>0.9997。方法检出限为0.032μg/kg,样品加标回收率在99.4%~102.1%之间,相对标准偏差低于3.7%。与原子荧光光谱法比较,二者鸡肉标准物质检测结果差异具有统计学意义,直接测汞法分析结果较好。且本方法样品检测时间为6.2 min,25份鸡肉样品3 h内即可检测完毕。结论本方法简单快速、检出限低、灵敏度高、结果准确,适用于鸡肉中汞含量的常规检测和食品污染监测,也为突发公共卫生事件的应急检测提供了新的选择。