鹅细小病毒、番鸭细小病毒及鸭圆环病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法,本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与DuCV Rep基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及DuCV的TaqMan荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、DuCV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒,结果显示,该方法仅能扩增出GPV、MDPV及DuCV,与其他主要水禽源病毒均无交叉反应,特异性强;利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及DuCV质粒标准品混合物,结果显示,该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10^(1)拷贝/μL,普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10^(3)拷贝/μL,表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR;该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及DuCV荧光定量PCR方法同时检测96份临床发病鸭的组织样品,该方法检测结果显示,共检出58份阳性样品,其中GPV检出率为18.75%(18/96),MDPV检出率为4.17%(4/96),DuCV检出率为37.50%(36/96),GPV与DuCV混合感染率为8.33%(8/96),阴性样品38份。与GPV和MDPV双重荧光定量PCR及DuCV荧光定量PCR方法的检测结果均一致,三者的符合率达100%。本研究建立的GPV、MDPV及DuCV多重TaqMan荧光定量PCR方法为临床鉴别检测该3种病原及其流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术手段。

2016-2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016-2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3600份,接种9~11日龄SPF鸡胚分离病毒,并结合血凝和血凝抑制试验及实时荧光定量RT-PCR方法鉴定AIV亚型,根据毒株检测年限和来源地选取部分H9亚型AIV核酸阳性样品进行HA、NA基因扩增、测序及进化动态分析。【结果】共获得46株H9亚型AIV广西毒株的HA、NA基因序列,其中HA基因全长1683 bp,编码560个氨基酸;4株NA基因全长1410 bp,编码469个氨基酸,42株缺失3个氨基酸,编码466个氨基酸。BLAST分析结果显示,越南及国内多个省份的毒株与本研究获得的广西毒株HA、NA基因相似性最高,分别为97.62%~99.88%和93.13%~99.79%,宿主源也不尽相同,表现遗传多样性特征。广西毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.0%~99.1%和94.6%~99.1%,NA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为83.9%~98.2%和86.1%~98.2%,表明HA基因较NA基因更为保守;与同期的参考毒株相似性高于早期,表明毒株存在持续进化。遗传进化分析结果显示,广西毒株的HA、NA基因属于当前优势流行的G57基因型分支,与疫苗株遗传关系较远。进化速率估算结果显示,HA、NA基因的平均进化速率分别为3.99×10^(-3)和4.59×10^(-3)替换/位点/年,最近共同祖先估算时间(tMRCA)分别为66.77和58.24年,表明HA基因比NA基因进化缓慢。重组分析结果显示,从鸡、鸭及环境中各分离到的毒株HA基因存在重组现象,主要亲本和次要亲本毒株均为人源的A/Beijing/1/2017株和禽源的A/quail/Hainan/250/2012株。【结论】当前H9亚型AIV广西流行毒株HA、NA基因与越南及国内省份的毒株相似性较高,具有遗传多样性特征,进化趋势以G57为优势基因型,与人源流感毒株发生基因重组,为新型流感产生创造条件。

2株海鸭源H3亚型禽流感病毒全基因组分子特征分析

【目的】了解广西沿海地区水禽H3亚型禽流感病毒的基因组分子特征。【方法】本研究通过RT-PCR一步法分段扩增法,对2020年从广西沿海地区分离到的2株海鸭源H3亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/S11359/2020(H3N1)与A/duck/Guangxi/S11374/2020(H3N8)进行全基因组测序与进化分析。【结果】2株H3亚型禽流感病毒的HA蛋白裂解位点序列均为340 PEKQTR↓GLFG 349,为低致病性禽流感病毒的分子特征,与受体嗜性关联的第226、228位氨基酸均为Q和T,可能仍主要结合禽类受体;BLAST分析结果显示,本研究H3N1亚型禽流感病毒的M、NP基因及H3N8亚型禽流感病毒的PA基因,与H7亚型禽流感病毒相似性最高,分别为99.5%、98.7%和98.9%,表明H3可能与H7亚型禽流感病毒发生了基因交换;2株H3亚型禽流感病毒与越南、孟加拉国、韩国等周边国家水禽源的H3、H4、H6、H7、H9等亚型相似性较高,可能拥有相同的进化来源;遗传进化分析表明,H3亚型禽流感病毒各基因进化分支均属于欧亚谱系,与水禽源毒株遗传距离较近,犬源、猫源的毒株次之,人源、猪源的毒株较远,但H3N1亚型禽流感病毒的NS基因与日本早期人源流感毒株A/Aichi/2/1968遗传关系最近,可能发生了基因置换。H3N8亚型禽流感病毒的HA基因检测有重组信号,重组的亲本毒株分别为A/duck/Beijing/40/04(相似性为93.1%)和A/canine/Beijing/20121215-34/2012(相似性为97.1%)。【结论】广西沿海地区的2株H3亚型禽流感病毒基因来源复杂,表现出遗传多样性特征。

食品中酵母菌的分离鉴定及其致腐能力

参照食品安全GB 4789.15—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》中酵母菌的检测方法,从水果、蜂蜜中分离筛选酵母菌并根据其26S r DNA D1/D2区序列进行鉴定。从蜂蜜、草莓、香蕉、橙子、油桃、芒果中共分离得到3株固囊酵母(Citeromyces matritensis)、3株异常威客汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、12株季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、1株长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、2株葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)和1株海洋酵母菌(Metschnikowia reukaufii)。将每种酵母菌接种于苹果、油桃和香蕉中与空白对照进行对比,以食品腐烂的速率来判断酵母菌的腐败能力,确定了W.anomalus和C.matritensis是上述3种水果中主要的腐败酵母菌,除此之外,M.reukaufii对油桃有较强的腐败作用,M.guilliermondii对香蕉的腐败效果明显。食品工业中加强对上述这些腐败酵母菌的检测与控制,可以更好地防止腐败酵母对于食品工业造成的危害。

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625μg/mL,待检血清稀释度为1∶40,封闭液为50g/L脱脂乳,酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶6 000,底物显色时间为室温避光15min,血清样本阴阳性临界值为OD450nm值≥0.33。与口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)、猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)抗体没有交叉反应。应用所建立的方法对广西2010年—2011年所采集的2 228份血清进行检测,被检血清样品平均阳性率为91.47%,被检猪场阳性率为100%。表明广西地区猪群感染普遍。

改良水化方案预防高龄患者造影剂肾病及改善焦虑情绪作用的临床研究

目的探讨改良水化方案在预防高龄患者造影剂肾病改善患者焦虑情绪的临床疗效。方法选取来我院行介入治疗的患者90例,随机平均分成对照组和改良组。对照组给予常规水化治疗。治疗组给予改良水化治疗。两组患者均在术前后测定血清肌酐含量以评定肾脏功能,均在介入术前后进行抑郁自评量表(SDS)和焦虑自评量表(SAS)评分,并根据得分判定患者情绪状态。结果介入术后,(1)第1 d,第2 d,第3 d,改良组血清肌酐明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)改良组有1例(2.2%)患者出现造影剂肾病,对照组有6例(13.3%),两组造影剂肾病发生率比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。(3)介入术后,改良组的SAS评分(38.6±2.5)与对照组(45.6±2.5)相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论改良水化方案对预防高龄患者造影剂肾病和改善患者焦虑情绪的临床疗效显著,值得推广。

鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

应用PCR方法从临床健康鸭脾脏样品中分段扩增获得鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)TD/41/09株全长基因组。测序结果表明,TD/41/09基因组全长为1994bp,含有4个开放阅读框(ORF),其中V1和C1是主要的2个ORF,分别编码Rep蛋白和Cap蛋白;在V1和C1的5′端之间存在与启动滚环复制有关的1个茎环结构和2个正向重复序列。遗传进化分析发现,TD/41/09与Ger(德国分离株)、LZ1109(广西分离株)、MH25(福建分离株)、33753-52(美国分离株)同处一个进化分支,而与PT07(福建分离株)、WS-GD010(广东分离株)和TC1/2002(台湾分离株)关系较远。

超高龄患者持续肾脏替代疗法开始时的心血管状态及超声心动图特点

目的了解持续床旁持续肾脏替代治疗(CRRT)的超高龄患者开始治疗时的心血管状态和超声心动图(UCG)特点。方法选择该院开始床旁CRRT病例43例,收集当时血压、症状(如气急等)、体征(胸水、水肿等)、实验室检查数据和UCG资料。计算心血管并发症和UCG异常发生率。分析UCG异常及相关因素。结果 CRRT开始时的心血管并发症:高血压41.9%、心律失常76.7%、心绞痛4.7%、收缩性心力衰竭18.6%、舒张性心力衰竭62.8%、周围血管病6.9%。UCG检出左心室肥厚(LVH)发生率39.5%,相关因素有高血压、贫血和低白蛋白血症有关。左室射血分数(LVEF)低于正常占18.6%,相关因素有缺血性心脏病、肺部感染、收缩压低等有关。左心室舒张功能不全占62.8%,相关因素有年龄、贫血和低白蛋白血症。结论 CRRT开始时患者心血管并发症和UCG异常的发生率很高。UCG异常和高龄、贫血、低白蛋白血症、高血压、缺血性心脏病、肺部感染有关。

氯沙坦对老年肾功能的保护作用观察

目的:通过与单用利尿剂及合用利尿剂和β-受体阻滞剂进行比较,观察氯沙坦对老年肾功能的保护作用。方法:将50例老年高血压肾损害的患者随机分为氯沙坦组(A组)和利尿剂组(B组),治疗3个月后,观察血压、蛋白尿、肾功能的变化及电解质紊乱等副反应。结果:2组均能有效降低血压,A、B两组血压分别由21.9±1.2/12.8±0.7kPa和21.6±1.1/12.7±0.6kPa降低到18.0±1.1/10.4±0.7kPa和18.2±1.2/10.4±0.7kPa(P<0.01)。A组24小时尿蛋白由0.99±0.33g降至0.78±0.31g(P<0.05),B组24小时尿蛋白由0.92±0.56g降至0.89±0.35g(P>0.05)。结论:对高血压合并肾损害患者,每天1次氯沙坦50mg或100mg能有效降低血压和尿蛋白排泄,具有保扩肾功能的作用。

腺病毒介导的Akt／mTOR基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

目的应用腺病毒技术下调Akt／mTOR表达水平，检测Akt／mTOR基因沉默对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法收集人肾癌及癌旁样品，RealtimePCR检测两组样品中Akt和mTOR的mRNA水平。利用病毒包装细胞293A获得靶向Akt／mTOR基因的重组腺病毒，感染人肾癌786-O细胞株。实验分2组：加人靶向Akt／mTOR基因的腺病毒感染的肾癌细胞组（rAd5-Am组），未处理的腺病毒感染的。肾癌细胞组（NC组）。应用Real timePCR及Western blot检测干扰前后Akt和mTOR mRNA及蛋白表达水平的变化。用细胞增殖及凋亡试剂盒检测Akt和mTOR沉默后，肾癌786-O细胞增殖、凋亡及PCNA表达水平的改变。结果与癌旁组织相比，Akt和mTOR的mRNA水平在肾癌组织中分别上调了2．613和3．254倍。成功获得knockdownAkt／mTOR的rAd5-Am腺病毒及对照腺病毒，感染肾癌786一O细胞。Real time PCR显示rAd5-Am组与NC组相比Akt／mTOR的mRNA水平分别下调65．3％和77．1％，Westernblot结果显示rAd5-Am组与NC组相比Akt／mTOR的蛋白表达水平分别下调78．4％和89．2％。rAd5．Am能显著降低786-O细胞中Akt／mTOR基因的表达。细胞增殖与凋亡实验表明，Akt／mTOR基因沉默后能显著抑制肾癌细胞786-O的增殖，并促进其凋亡（rAd5-Am组细胞凋亡率是NC组的2．57倍）。进一步的实验结果表明，Akt／mTOR下调后能降低PCNA的蛋白量，从而抑制。肾癌细胞的增殖。rAd5-Am感染的。肾癌786-O细胞的增殖和PCNA蛋白量受到抑制，而凋亡率增加。结论构建出能稳定干扰Akt／mTOR基因表达的。肾癌786-O细胞株。Akt／mTOR腺病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性Akt／mTOR基因，抑制肾癌786-O细胞的增殖，下调PCNA的表达，并促进细胞凋亡。

氯沙坦治疗老年高血压伴肾损害的疗效观察

目的 探讨氯沙坦在老年高血压伴肾损害病人中，对蛋白尿的影响。方法 ３０例老年高血压病患者，平均年龄７７．３６ ± ５．６岁，口服氯沙坦，疗程１２周，治疗前后观察血压，２４小时尿蛋白，肾功能变化。结果 氯沙坦能有效地降低尿蛋白排泄［２４小时尿蛋白（ｇ／２４ｈ）：０．９９±０．３３降至０．７８±０．３１，Ｐ＜０．０５），与其他降压药联合服用有更好的降压作用。结论 对高血压合并肾损害患者，每日１次氯沙坦５０ｍｇ或１００ｍｇ能有效降低尿蛋白排泄，其机理可能是肾内血流量的改变所致。

诱导型一氧化氮合酶对二甲氧乙二酰甘氨酸预处理晚期肾保护作用的影响

目的探讨脯氨酸羟化酶抑制剂二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG)预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤(IRI)的晚期保护作用以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在此过程中的作用。方法 24只雄性C57/BL小鼠随机分为4组:假手术(sham)组、IRI组、DMOG预处理组(DMOG+IRI)和GW274150干预组(GW274150+DMOG+IRI)。采用夹闭双侧肾蒂30min再灌注24h方法建立小鼠肾IRI模型。观察DMOG预处理及特异性iNOS抑制剂GW274150干预对小鼠肾功能、肾组织病理和细胞凋亡的影响;并应用Westernblot方法检测低氧诱导因子(HIF-1α)和iNOS蛋白的表达。结果 DMOG预处理组小鼠肾功能、肾组织病理学和肾组织细胞凋亡程度均较IRI组显著改善,GW274150干预可使以上作用明显减弱。结论 DMOG预处理对IRI产生晚期肾保护作用,iNOS抑制剂可削弱这种保护性影响,意味着iNOS参与了HIF-1α活化引发的晚期肾保护作用。

大压下率对连轧驱动等通道转角大应变技术的影响

采用有限元软件DEFORM-3D模拟了连轧驱动等通道转角大应变技术,研究了大轧制压下对大应变技术的影响。结果表明,当摩擦系数低(0.12)时,工件与轧制轮之间出现打滑现象,在转角变形区出现沿弯曲通道向上位置的镦宽现象;在摩擦系数过高(0.5～0.7)时,进入弯曲通道,出现明显的轧宽现象,在出口通道处,工件出现破损现象;在摩擦系数适中(0.3)时,工件变形流畅,工件在出口通道内未填满通道宽度。随着轧制压下率增大,有效应变增大,但能耗增加。

小剂量重组人类红细胞生成素治疗老年肾性贫血

目的:观察小剂量重组人类红细胞生成素治疗老年肾性贫血的疗效、副反应,并与常规剂量重组人类红细胞生成素进行比较。方法:将36例老年终末期肾病患者随机分为小剂量组(A组)和常规剂量组(B组),治疗3个月后,观察红细胞压积、生活质量的变化及血压升高、血栓性疾病等副反应。结果:2组红细胞压积均有显著升高,生活质量明显改善。A组20例仅发生1例血压升高,B组16例中有5例发生血压升高,同时有1例发生动静脉内瘘阻塞。结论:使用小剂量重组人类红细胞生成素是治疗老年肾性贫血的安全、有效、可行的方法。

羔羊感冒通中毒

1 发病情况6月18日天气突变,养羊专业户杨某饲养的山羊羔21只发生打喷嚏、流鼻涕等感冒症状,用感冒通治疗,每只羔羊5片,研成细末灌服.上午8时灌药,傍晚7时发现羔羊表现异常,背毛松乱,精神萎顿,垂头闭目,伏卧不起,拉稀粪,先后共死亡7只,死亡率为33%.其发病死亡的特点是体质衰弱的先发病,症状明显,死亡率高.死羊口流粘液,尸僵不全.经剖检,实验室检查及动物试验等诊断为感冒通中毒.

PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。