肺癌DC融合细胞诱导的抗肿瘤免疫应答

目的研究肺癌 DC融合细胞 FL D- A11体内外诱导免疫应答的能力。方法用 MTT法测定 FL D- A11细胞诱导淋巴细胞增殖的能力 ;EL ISA法检测其诱导淋巴细胞分泌 IL- 2的水平 ;L DH释放法测定 FL D- A11细胞免疫后小鼠脾淋巴细胞的特异性 CTL 活性。结果 FL D- A11细胞能有效刺激淋巴细胞的增殖反应 ( SC∶ RC=1∶ 5 0时 ,SI=2 .3 8) ,诱导淋巴细胞分泌 IL- 2。 FL D- A11细胞免疫后 ,小鼠的胸腺和脾脏重量均高于对照组 ( P<0 .0 5 ) ,脾淋巴细胞对 L ewis肺癌细胞的杀伤活性显著高于对照组。结论 FL D- A11细胞具有诱导初次抗肿瘤免疫应答的能力 ,不仅能在体外诱导淋巴细胞的增殖和 IL- 2的分泌 ,而且体内免疫接种也能引起小鼠免疫器官的增生反应 ,产生针对 L ewis肺癌的特异性 CTL 杀伤作用。

HGPRT缺陷型Lewis肺癌细胞株的筛选及其生物学特征

目的 为细胞融合等实验提供次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺陷细胞株。方法 用 8 氮杂鸟嘌呤 ( 8 AG)对Lewis肺癌细胞株L3 8进行长期渐进式给药 ,从中克隆筛选出HGPRT缺陷细胞株 ,并观察其体内成瘤和肺转移特性。结果 经过 1年的筛选鉴定 ,获得了在 2 0mg/L 8 AG和 16 40培养液中能长期稳定生长 ,在HAT选择性培养基中不能形成克隆的AL990 1细胞株。AL990 1和L3 8的染色体众数分别为5 8和 6 2 ,在C5 7BL/ 6小鼠体内成瘤率均为 10 0 % ( 10 / 10 ) ,肺转移率分别为 30 % ( 3/ 10 )和 70 % ( 7/ 10 )。结论 HGPRT缺陷型AL990 1细胞株基本保持了L3 8细胞的生物学特征 ,可作为制备Lewis肺癌DC融合疫苗的亲本抗原细胞。

小鼠 Lewis 肺癌细胞株L3-8的建立及生物学特征

为了得到高转移率的小鼠肺癌体外传代细胞株，将Ｌｅｗｉｓ肺癌实体瘤组织在体外进行１４个月的传代培养，获得了Ｌ３－８细胞株。对该细胞生物学特征的研究结果表明，第３９代和第６５代细胞的倍增时间分别为２３．５ｈ和２６．２ｈ；第８０代细胞的平皿和软琼脂集落形成率分别为３０．７％和２１．２％；在Ｃ５７ＢＬ小鼠体内的成瘤率为１００．０％，肺转移率为８３．３％，平均转移灶２．９个。此细胞株较原体内传代株具有更高的转移率，为肿瘤细胞生物学。

Lewis肺癌耐药细胞的诱导及其耐药性的初步研究

目的 建立肺癌耐药动物模型 ,诱导耐ADM的Lewis肺癌细胞株 ,并鉴定其生长特性、细胞内药物的释放特性及耐药谱。方法 用渐进式给药法诱导建立耐ADM的Lewis肺癌细胞株 ,绘制生长曲线 ,计算倍增时间 ;用IPP图象分析系统观察比较耐药细胞及其亲本细胞内ADM和Rh B的荧光光密度 ;荧光分光光度计法测定细胞内ADM含量并绘制ADM释放曲线 ;MTT法测定细胞的IC5 0 ,计算耐药指数。结果 经 14个月的诱导培养获得了能在 0 .4μg mlADM中稳定生长的Lewis肺癌细胞株———L3 8/ADM ,其在动物体内的成瘤率为 10 /10 ;在 0 .15mg/lADM和普通 164 0培养基中的倍增时间分别为 2 2 .0h和 2 1.8h ;在 4mg/lADM和Rh B中培养后 ,耐药细胞及其亲本细胞内的荧光光密度比分别为 2 .82∶1和 2 .65∶1,耐药细胞内的ADM含量仅为其亲本细胞的 64 .7% ,但其药物释放速度无明显差异。L3 8/ADM细胞除对ADM耐药外 ,对DNR、VCR、MIT和CDDP也有不同程度的耐药性。结论 L3 8/ADM是一株典型的MDR细胞株 ,其耐药作用可能是由于胞膜的药物渗透受阻所至。

5-FU-PLA微球的肺癌杀伤效应研究

目的 研究生物可降解抗癌药 5 FU PLA微球的释药特点 ,鉴定其体外杀伤肿瘤细胞的活性。方法 采用恒温振荡透析法和一阶导数紫外分光光度法测定 5 FU PLA微球的药物释放特性 ;MTT比色法测定不同时相 5 FU PLA微球对人和小鼠肺癌、胃癌、肝癌等细胞株的杀伤活性。结果 5 FU PLA微球的半数释放期 (t 1/ 2 )为 10 .4天 ,释放过程未表现出爆破效应 ( 2 4小时释放 19.4% )。 5 FU PLA微球对肺癌等细胞株有较强杀伤活性 ,其中肺癌和胃癌较肝癌更为敏感 ;5 FU PLA微球的肿瘤杀伤活性与作用时间和释药量呈正相关关系。结论 5 FU PLA微球的抗癌药物分布均匀 ,具有良好的缓释功能 ,微球制备和释放过程对 5 FU的药效无影响。 5 FU PLA微球能在较长时间内维持有效的杀瘤活性。本研究为 5 FU PLA微球用于肺癌等肿瘤的介入治疗提供了实验依据。

5Fu-聚乳酸微球的体外释药及其抗癌效应研究

目的 研究生物可降解抗癌药 5Fu PLA微球的释药特点 ,鉴定其体外杀伤肿瘤细胞的活性。方法 采用恒温振荡透析法和一阶导数紫外分光光度法测定了 5Fu PLA微球的药物释放特性 ;MTT法测定了不同时相 5Fu PLA微球对 5种肿瘤细胞株的杀伤活性。结果 5Fu PLA微球具有良好的缓释功能 ,半量释放期t1/2 为 10 .4天。 5Fu PLA微球对 5种肿瘤细胞株均有较强的杀伤活性 ,且杀伤活性与作用时间和释药量呈正相关关系。结论 5Fu PLA微球中药物分布均匀 ;微球制备和溶蚀过程对5Fu的药效无影响。 5Fu PLA微球具有良好的缓释功能 ,能在较长时间内维持有效的杀伤活性。

胃肠道恶性肿瘤患者治疗前后血清CEA水平的动态分析

目的 :探讨治疗前后不同时期胃肠道恶性肿瘤患者血清CEA水平的变化规律及临床意义。方法 :采用CEA单克隆抗体酶联免疫检测试剂盒 ,检测患者血清CEA水平 ,用统计学方法对检测结果进行比较分析。结果 :胃肠道恶性肿瘤患者手术前CEA水平显著高于健康人(P<0.005) ,手术后CEA普遍降低至较低水平。当患者再进行化疗时 ,化疗结束后60天内81.8%(18/22)的患者血清CEA有升高现象 ;61天～180天再次复查时 ,其中13例患者CEA水平又降至化疗前的水平。结论 :手术治疗可降低胃肠道恶性肿瘤患者的血清CEA水平 ;化学药物治疗可使患者出现短暂的(60天内)、可恢复的血清CEA升高过程 ,在此期间内CEA值尚不能作为肿瘤复发或转移的指征。动态分析患者CEA水平对肿瘤诊断和疗效评价有重要意义 ,化疗后患者CEA水平升高的机制待进一步研究。

肺癌树突状融合细胞的制备及其生物学特征

目的探讨利用杂交瘤技术制备肿瘤疫苗的方法 ,研究肺癌树突状融合细胞的生物学特征。方法 用 PEG法将 HGPRT缺陷型 L ewis肺癌细胞株 AL990 1 与小鼠骨髓诱生的树突状细胞进行融合 ,HAT筛选融合克隆 ;S- P免疫细胞化学法鉴定融合细胞表型 ;对融合细胞进行生长曲线、克隆形成和体内成瘤等鉴定。结果树突状细胞与 AL990 1 以 6∶ 1比例融合 ,融合率约为 30 %。融合细胞 FL D- A1 1 可在体外传代培养 ,表型为 CD80 + 、CD40 + 、H- 2 Kb + 、MIDC+ 和肺癌抗原阳性。 FL D- A1 1不能在软琼脂培养基中形成克隆 ,动物体内不能形成肿瘤。结论利用杂交瘤技术制备的 FL D- A1 1 细胞 ,具备了在体内激活抗特异性地抗肿瘤细胞免疫功能的分子表型 ;该细胞不存在体内成瘤的危险。本研究为 FL D- A1 1 作为肿瘤疫苗 。

不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响

目的探讨获得大量、高纯度、高活性骨髓间充质干细胞(BMSCs)的有效途径。方法用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化BMSCs,在无血清、含小牛或胎牛血清以及不同体积分数的胎牛血清的培养基中培养,传代扩增,观察各组细胞形态、生长特性,测定生长曲线,免疫细胞化学染色鉴定表面抗原,电镜观察细胞显微结构。结果密度梯度离心法可获得较纯的原代细胞,但细胞增殖缓慢,容易老化;贴壁法分离的细胞生长增殖迅速,经传代换液,第4代细胞基本纯化;小牛和胎牛血清均能促进BMSCs生长增殖,但在体积分数为0.12的胎牛血清中集落形成率最高(46.50%);细胞表达CD44、CD90,而CD14、CD45阴性;电镜下BMSCs符合干细胞的一般特性。结论经多次换液、严格控制传代消化时间(2～3min)和酶浓度(2.5g/L),采用贴壁纯化法在含体积分数为0.12的胎牛血清L-DMEM培养液中培养可获得大量、高纯度、高活性的BMSCs。

大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定

目的通过改进胰腺消化和分离的技术条件,提高成年大鼠胰岛分离纯化产率和质量。方法用胶原酶Ⅺ液灌注消化成年SD大鼠胰腺,对胰岛分离纯化方法加以改进:以4种比重的Euro-Ficoll(F1:D=1.132,F2:D=1.108,F4:D=1.069)Hank’s(F5:D=1.023)不连续密度梯度离心,以离心半径15cm,2000r/min于4℃缓慢升降离心20min,收集位于F1和F2界面的胰岛。双硫腙特异染色法鉴定胰岛纯度;二醋酸酯荧光素/碘化丙啶染色法计算胰岛成活率;放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,计算刺激指数。将胰岛当量(islets equivalent quantity,IEQ)为1000的胰岛移植于同品系糖尿病大鼠肾包膜下,9d内隔日观察动物血糖的变化,评价胰岛功能。比较分离条件优化前后收获胰岛的产率和质量。结果改进纯化方法后每只大鼠胰岛收获量为(920±122)IEQ,胰岛纯度>90%,胰岛细胞成活率为91%±2%。胰岛细胞功能良好,在低糖和高糖刺激后培养液中胰岛素浓度分别为(18.25±0.32)mU/L和(36.70±3.57)mU/L,刺激指数为2.01±0.15。1000 IEQ胰岛移植于糖尿病大鼠肾包膜下,观察期内可维持动物血糖水平正常。结论改进后的胶原酶灌注消化和不连续梯度离心方法提高了胰岛的产率,保证了胰岛的高纯度及高成活率。

不同营养支持途径对外科创伤应激后相关肠黏膜形态和屏障功能影响的实验研究

目的探讨肠外和肠内营养对外科创伤应激大鼠肠上皮细胞紧密连接、屏障功能及微生态环境的影响。方法SD大鼠随机分成对照组、全肠外营养组(TPN)和普通肠内营养组(EN)。建立创伤应激模型,接受等氮、等能量营养支持后光镜和电镜下观察肠黏膜形态,比较肠道细菌脏器移位率、肠黏膜occludin蛋白免疫组化表达及肠道菌群数量等。结果电镜下TPN组肠上皮损伤程度较严重,而EN组损伤程度较轻,肠上皮紧密连接、微绒毛较完整;光镜下Chiu分级,TPN组和EN组比较差异有统计学意义(P<0.05)。EN组肠道跨膜结合蛋白表达优于TPN组(P<0.05)。EN组肝、肺和肠系膜淋巴结的肠道细菌移位率低于TPN组(P<0.05)。EN组肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌数量均高于TPN组,但差异未达到统计学意义。结论肠内及标准肠外营养都不能完全维持创伤大鼠肠黏膜屏障不受损害及阻止肠道细菌移位,但肠内营养组肠黏膜屏障损害较轻,肠道细菌移位率低,且增加了肠上皮occludin蛋白表达,与肠外营养比较,有利于改善肠道屏障,从而减少细菌移位的可能。

高强度聚焦超声对人乳腺癌细胞的生长抑制作用及机理研究

目的 研究高强度聚焦超声 (HIFU)对人肿瘤细胞的杀伤作用 ,并探索其作用机理。方法 用不同强度HIFU处理人乳腺癌细胞 MCF- 7,用台盼蓝排斥法染色、细胞增殖试验 (MTT法 )、克隆形成实验研究 HIFU对癌细胞的杀伤和生长抑制作用 ;用流式细胞术检测 HIFU对癌细胞周期、凋亡及相关基因表达的影响。结果 用 HIFU处理后 ,癌细胞死亡率升高 ,增殖活性降低 (P<0 .0 5 ) ,克隆形成下降 (P<0 .0 0 1) ,G0 /G1 期细胞数增加 (P<0 .0 5 ) ,S期细胞数减少 (P<0 .0 1) ,凋亡指数升高 (P<0 .0 1) ,热休克蛋白表达升高 (P<0 .0 5 ) ,P5 3、BCL- 2、FAS表达阳性细胞数与对照组比 ,无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论 HIFU对人乳腺癌细胞有明显的杀伤及抑制生长和克隆形成作用 ,其机理与抑制 DNA合成有关 ;HIFU具有诱导癌细胞凋亡作用 ,可能与 P5 3、BCL- 2、FAS的介导和调控无关。

体外诱导成熟树突状细胞的研究

目的 :探讨在体外从干细胞中诱导出成熟DC的适宜环境。方法 :分别将人胎肝、骨髓和脾细胞以及小鼠骨髓和脾细胞在体外用GM CSF和TNF α诱导 ,观察了第 3、5、7天DC的收获情况。进一步用S P免疫细胞化学染色检测了mBmDC和fLDC有关分子表达。结果 :在体外通过GM CSF和TNF α的作用 ,小鼠骨髓、人胎肝、骨髓细胞呈典型的毛刺状胞浆突起 ,第5天的收获率分别为 :39 5 %、6 7 2 %、12 9% ,而基本不能从脾细胞中诱导出成熟DC ,获得的DC能与MAbCD80、MAbCD40呈强阳性反应。结论 :在GM CSF和TNF α的共同作用下 ,能在体外从人胎肝、骨髓和小鼠骨髓干细胞中获得成熟DC ,其DC能表达高水平的B7 1和CD40分子 ,这为大量获取DC提供了一种简便可行的手段 ,为研究DC的生物学特征及其抗原提呈功能提供了丰富的材料 。

枯草芽孢杆菌PY-1对柑橘采后病害的生物防治

[目的]以枯草芽孢杆菌PY-1为拮抗菌研究其对柑橘果实采后由指状青霉引起的绿霉病的防治作用。[方法](1)体外实验:在混有病原菌孢子的PDA平板上接种PY-1和PY-1发酵滤液。(2)体内实验:对柑橘果实人工接种绿霉病,测定PY-1菌悬液、发酵液、无菌发酵液、热处理发酵液对绿霉病以及对菌斑扩展的抑制作用。[结果](1)体外实验中PY-1及其发酵滤液均表现出对病原菌的抑制作用。(2)与对照组相比,PY-1的四种处理液均对绿霉病以及菌斑的扩展有较好的抑制作用,抑制效果强弱依次是:发酵液,菌悬液,无菌发酵液,热处理发酵液。[结论]PY-1可作为生物拮抗菌应用于柑橘果实采后绿霉病的生物防治。

突变Ki-ras基因修饰的肺癌DC疫苗的体外抗癌活性

目的 探讨以Ki ras基因 12位密码子点突变为靶点 ,构建DC Ad Ki ras(V12 )肺癌疫苗及其抗肺癌免疫治疗的可能性。方法 应用重组腺病毒的方法将人Ki ras基因 12位密码子点突变 (由甘氨酸转变为缬氨酸 )的cDNA导入DC ,构建DC Ad Ki ras(V 12 )肺癌疫苗 ,以流式细胞术、PCR、MLR和CTL等方法检测其免疫活性。结果 ( 1)DC Ad Ki ras(V12 )肺癌疫苗不仅能表达人Ki ras(V12 )基因 ,且能明显刺激T细胞增殖及提高CTL的杀伤作用。 ( 2 )突变Ki ras基因修饰的DC免疫小鼠后 ,可产生针对表达Ki ras(V 12 )基因的Lewis肺癌的特异性杀伤作用 ,但对B16黑色素瘤细胞则无明显杀伤作用。结论 以人突变Ki ras基因修饰的肺癌DC疫苗可在体外特异性诱导抗可表达Ki ras(V 12 )基因的Lewis肺癌的活性。

IL-3对小鼠骨髓来源树突状细胞分化发育的影响

比较 GM- CSF+IL- 4与 IL- 3+IL- 4两种方法培养制备的树突状细胞 (Dendritic cell,DC)在形态、产量、免疫表型和抗原摄取能力方面的差异。用 GM- CSF+IL- 4和 IL- 3+IL- 4分别诱导小鼠骨髓来源的前体细胞分化为成熟树突状细胞 ,通过相差显微镜、扫描电镜、激光共聚焦扫描显微镜进行形态观察 ,流式细胞术分析细胞免疫表型和摄取抗原能力。结果表明 ,IL- 3+IL- 4诱导的 DC产量高 ,细胞纯度好 ,形态上与 GM- CSF+IL- 4诱导的DC类似 ;细胞免疫表型显示高表达 MHC 类分子 ,但低表达或不表达 CD80、CD86 ;IL- 3+IL- 4诱导的 DC具有强大的摄取抗原能力。 IL- 3替代 GM- CSF可诱导低表达共刺激分子的耐受型

负载肺癌抗原DC疫苗抗肿瘤免疫实验

目的探讨负载人肺癌细胞株A549冻融抗原DC疫苗体外抗肿瘤免疫效应。方法自脐血分离单核细胞,经rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α诱导树突状细胞(DC),负载人肺癌细胞株A549冻融抗原、LPS诱导成熟,利用免疫磁珠分选获得功能性肺癌DC疫苗(UbDC/AgL),ELISA测定UbDC/AgL培养上清中细胞因子浓度、LDH法测定特异性细胞杀伤(CTL)活性及MTT法检测自身混合淋巴细胞反应(AMLR)。结果UbDC/AgL细胞组IL-1、IL-12、IL-6和IFN-β含量明显高于UbDC/Ag和UbDC组(P<0.01);UbDC/AgL疫苗细胞能有效诱导肿瘤特异性CTL活性,对A549细胞有特异性杀伤作用(P<0.01),并能有效促进淋巴细胞增殖。结论负载肿瘤冻融抗原DC疫苗,能有效激活T淋巴细胞进而诱导肿瘤特异性杀伤效应。

血管内皮衰老和氧化应激

内皮活性氧主要来源于线粒体、内皮一氧化氮合成酶和NADPH氧化酶4。过量活性氧是氧化应激的主要原因,也是内皮衰老及相关疾病的主要原因之一。但细胞已经进化出合适的抗氧化信号通路及时清除过量活性氧,如Nrf2/Keap1-ARE、PPARγ、SIRT和FOXO等。其中,Nrf2/Keap1-ARE信号通路是目前已知的最强大内源性抗氧化信号通路。而且,这些通路之间可以协同作用抵抗氧应激损伤并促进细胞存活。对内皮衰老和氧化应激之间的关系理解有助于提供防治氧化应激相关疾病有用信息。

恶性肿瘤特异性生长因子对肺癌诊断价值的研究

目的 评价血清恶性肿瘤特异性生长因子 (TSGF)在肺癌的诊断及鉴别诊断中的价值。方法 随机选择 6 0例肺癌患者及 5 0例肺部良性疾病患者进行血清 TSGF检测 ,并与癌胚抗原 (CEA )进行比较 ,分析 TSGF和 CEA诊断肺癌的敏感性、特异性和准确性。结果 肺癌组血清 TSGF和 CEA水平明显高于肺部良性疾病组 ,两组间有显著性差异 (P<0 .0 5或 P<0 .0 1)。结论 TSGF在恶性肿瘤的诊断方面具有良好的敏感性、特异性和准确性 ,在肺癌的早期诊断及鉴别诊断中 。