紫外线对大鼠晶状体抗氧化酶mRNA表达水平的影响

为探讨紫外线对晶状体的损伤机制，用ＲＴ－ＰＣＲ方法（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，反转录聚合酶链反应），研究经紫外线照射后大鼠晶状体抗氧化相关酶，包括铜锌－超氧化物歧化酶（ｃｏｐｐｅｒ－ｚｉｎｃ－ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，Ｃｕ－Ｚｎ－ＳＯＤ），谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕ－ｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨ－Ｐｘ）和过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）等ｍＲＮＡ的表达．结果显示，短时间的照射（２～５ｍｉｎ），抗氧化相关酶的ｍＲＮＡ表达水平有增高表现，随后其ｍＲＮＡ表达水平开始下降，１５ｍｉｎ时抗氧化相关酶ｍＲＮＡ的表达下降更为明显，与对照组相比有非常显著性差异（Ｐ＜０．００１）．照射后２４ｈ，抗氧化相关酶的ｍＲＮＡ表达有不同程度的恢复；照射后４８ｈ，其ｍＲＮＡ表达水平基本恢复，与对照组相比没有显著性差异．

rhTPO的分子克隆表达及活性测定

目的；分子克隆并表达具有生物学活性的人血小板生成素（rhTPO）。方法：采用PCR、序列测定、原核表达及亲和层析法。结果：以人全长的TPOCDNA为模板[1]，用PCR法获得了编码195个氨基酸残基的hTPO195cDNA并克隆至原核表达质粒pMal－p2中，以麦芽糖融合蛋白（MBP）方式进行了表达。经Amylose树脂系和层析纯化获得了较高纯度的rhTPO195融合蛋白。生物学活性测定结果显示，其促进体外培养的巨核细胞集落形成与日本麒麟（Kirin）公司产品类似。结论；获得了具有天然生物学活性rhTPO，并在原核细胞中获得表达。

以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法：将人全长血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）基因克隆至ｐＢａｃＭａｍ２载体，与ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞，经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒，以此为载体，将人ＴＰＯ基因导入小鼠体内。结果：获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株，动物实验外周血小板计数升高至正常的２～３倍，ＲＴＰＣＲ结果显示ＴＰＯ在小鼠组织中得到表达。结论：重组ｒｈＴＰＯ昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。

血小板生成素是人红白血病HEL细胞自分泌因子的证据

为了研究人红白血病HEL细胞有自分泌血小板生成素(Tpo)的能力,采用细胞原位杂交检测mRNA,采用免疫荧光方法、生物素亲和素系统检测蛋白质,采用细胞传感器检测细胞电化学行为。结果表明:Mpl是细胞膜受体;HEL细胞内存在Tpo蛋白质;在培养基中加入rhTpo后HEL细胞增殖;可溶性受体融合蛋白可以阻断HEL细胞增殖,阻断后HEL细胞的电子传递数减少,但细胞数高于接种细胞数。实验结论提示Tpo可能是HEL细胞的自分泌因子。

从人胚胎胰腺中分离获得巢蛋白表达阳性的细胞

目的 探讨从人胚胎胰腺组织分离巢蛋白 (Nestin)阳性细胞并进行体外传代培养的方法。 方法 取引产的16、18、2 0周人胚胎胰腺组织 ,分离胰岛样细胞簇 (Islet-likecellclusters,ICCs) ,进行体外培养。用免疫组织化学和逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)方法检测巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因 - 1(Pancreaticandduodenalhomeoboxgene - 1,PDX - 1/IPF - 1)以及胰岛内分泌激素胰岛素和胰升糖素 (Glucagon)的表达。 结果 ICCs经体外培养可获得巢蛋白表达阳性细胞 ,这种细胞可进一步形成球状细胞簇 ,除有巢蛋白阳性细胞外 ,还有PDX - 1、胰岛素和胰升糖素表达阳性的细胞 ,并且细胞可连续传代。结论 从人胚胎胰腺组织中可分离获得巢蛋白表达阳性细胞 ,这种细胞可在体外增殖并有向胰岛内分泌细胞分化的能力。

子宫肌瘤中抑癌基因p53和Rb的表达

目的：探讨抑癌基因p53和Rb在子宫肌瘤发生发展中的作用。方法：用NorthernBlot方法检测14例子宫肌瘤和3例子宫平滑肌肉瘤中p53和Rb基因的mRNA表达。结果：p53和Rb基因在分泌期子宫肌肉中的表达水平明显高于增殖期，在子宫肌瘤中的表达水平明显低于分泌期子宫肌肉组织，在子宫肉瘤中的表达水平低于子宫肌瘤。结论：在子宫肌肉组织中，性激素对p53和Rb基因的表达可能有调节作用。推测性激素促使子宫平滑肌细胞增生的作用途径之一是影响p53和Rb基因的表达。

巢蛋白基因沉默通过激活细胞周期依赖性激酶(cdk5)促进大鼠神经胶质瘤细胞C6的迁移和增殖(英文)

中间纤维蛋白巢蛋白(nestin)在各种胚胎前体细胞及成熟组织中均有表达.近年一些研究显示,巢蛋白的表达上调和一些恶性肿瘤的病理特征有相关性.但是,巢蛋白在干细胞分化及肿瘤发生中的作用还不为人知.在本研究中,我们运用短发卡状的RNA为工具,以大鼠神经胶质瘤细胞系C6为模型,对巢蛋白的功能进行了研究.划痕实验和迁移实验的结果均显示,巢蛋白基因沉默可以促进C6细胞的迁移.同时,BrdU渗入实验显示,此过程伴随着细胞增殖的增加.进一步研究显示,细胞周期依赖性激酶cdk5的活性在此过程中有显著的增加.此外,巢蛋白基因沉默所引起的迁移改变可以被cdk5特异性抑制剂roscovitine所回复,而对细胞增殖则没有显著影响.综上所述,本研究揭示了巢蛋白基因沉默与神经胶质瘤细胞的迁移和增殖相关,而cdk5是此过程的重要调节因子.

分子克隆人血小板生成素基因

目的：克隆人血小板生成素基因，方法：采用ＲＴ一ＰＣＲ的方法。结果：从人胎肝中克隆出全长的血小板生成素（ＴＰＯ）基因，并亚克隆至ＰＵＣｌｌ８载体中。该ｃＤＮＡ全长１０６２ＢＰ，编码３５３个氨基酸，经序列测定与Ｂａｒｔｌｅｙ等人报道的完全一致［１］。结论：已获得人血小板生成素基因，此项工作为基因工程生产ＴＰＯ奠定了良好基础。

抗人TPO单克隆抗体的制备

目的：制备抗人血小板生成素（hTPO）单克隆抗体，用于建立ELISA方法和检测TPO的表达。方法：用基因重组的hTPO免疫Balb／c小鼠，常规法做细胞融合，用ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株。结果：获得一杂交瘤细胞株（46-6），其免疫球蛋白亚类为IgG1经ELISA和免疫印迹技术证明，此单抗能特异识别TPO。结论：46－6单克隆抗体（McAb）特异性强。用其建立的夹心ELISA检测TPO的方法线性好，灵敏度可达50ng／L。

PCR片段测序和基因分型两种方法对肯尼迪病的诊断(英文)

X连锁脊延髓肌萎缩症(SBMA)或肯尼迪病是一种成年人发病的神经变性疾病,以肌无力与慢性、进行性肌萎缩为特征.通过PCR片段测序和基因分型法准确检测雄激素受体(AR)基因CAG复制数目,兄弟俩(来自同一个中国家庭)被确诊为隐性遗传性SBMA.为了得到该中国家庭SMBA家系人员AR基因的CAG复制数目,我们采用了PCR片段测序和基因分型两种方法.在该SMBA家系中有两个已发病的成年男性、未发病的年轻男性,及女性基因携带者.两个已发病男性患者AR基因中CAG三核苷酸串重复数目分别是48和45.以前的研究表明特定三核苷酸串重复数目的扩增可导致人类遗传性神经障碍疾病发病。我们的研究结果完全支持这一观点,SMBA中国家系的三核苷酸CAG拷贝数目检测结果表明,AR基因CAG扩增数目与SMBA发病相关.

人胚胎脑室脉络丛上皮细胞表达神经干细胞分子标志

目的探讨人12周龄胚胎脑脉络丛上皮细胞是否具有神经干细胞的生物学特性。方法制备室管膜/室管膜下区和纹状体脑切片和脉络丛组织铺片,采用免疫荧光染色,在激光扫描共焦显微镜下观察结果,采集图像数据。结果人12周龄胚胎脑室脉络丛上皮细胞表达神经干细胞分子标志CD133、Nestin和Sox2。神经干细胞的分子标志在脉络丛上皮细胞的分布具有一定极性,未见共定位分布。室管膜上皮细胞面向脑室腔面的细胞顶端微绒毛也表达CD133,而室管膜下区和纹状体区可见极少数CD133阳性标记细胞。结论 12周龄脑室脉络丛上皮细胞已定向分化,不仅提供维持神经干细胞的微环境,还具有神经干细胞的生物学特性。

强力霉素调控血小板生成素在CHO细胞中的表达

本实验应用Tet On基因表达系统 ,通过强力霉素调控血小板生成素 (TPO)基因在CHO细胞中的表达。应用DNA重组技术 ,构建质粒 pTRE TPO。应用脂质体介导的基因转染技术 ,pTRE TPO与pTK Hyg共转染CHO Tet On细胞株 ,得到双稳定细胞株CHO Tet On TPO ,并筛选高表达、低背景克隆。当培养基中不加强力霉素时 ,RT PCR和Western印迹未见TPO表达 ,ELISA测定培养上清TPO水平为 0 .1μg/L。当培养基中加入 2mg/L强力霉素时 ,RT PCR和Western印迹可见TPO表达条带 ,ELISA测定培养上清TPO水平为 10 .8μg/L ,两者相差 10 8倍。本试验通过强力霉素调控TPO基因在CHO细胞中的表达 ,有望为TPO基因治疗提供一条可控的安全途径。

诱导胶质纤维酸性蛋白阳性神经前体细胞系向神经元分化

目的 :探讨来源于人胚胎脑室下区 (SVZ)的胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)阳性神经前体细胞系向神经元分化的潜能。方法 :分别采用定量RT PCR、Western印迹分析及免疫荧光染色检测被全反式视黄酸诱导前后GFAP阳性神经前体细胞系中神经干细胞和神经元特异性标志物表达量的变化情况。采用免疫荧光染色检测GFAP阳性神经前体细胞系移植到动物体内后神经元特异性标志物表达情况。结果 :在体外诱导后 ,GFAP阳性神经前体细胞系中神经元特异性标志物在mRNA和蛋白水平的表达量上升 ,而神经干细胞标志物表达量下降。移植动物体内 ,GFAP阳性神经前体细胞系可分化产生神经元。结论 :GFAP阳性神经前体细胞系在体内外可以向神经元诱导分化。

血小板生成素基因在NIH/3T3细胞中的表达与调控

应用 Tet- On基因表达系统 ,调控血小板生成素 (TPO)基因在 NIH/3T3细胞中的表达时间与水平 .籍脂质体介导的基因转移方法 ,p Tet- On质粒转染 NIH/3T3细胞株 ,得到稳定细胞株NIH/3T3- Tet- On.p TRE/TPO与 p TK- Hyg质粒共转染 NIH/3T3- Tet- On细胞株 ,得到双稳定细胞株 NIH/3T3- Tet- On- TPO.在培养基中加入或不加强力霉素 ,RT- PCR、Western印迹及 ELISA法检测培养上清 TPO表达 .结果表明 ,当培养基中不加强力霉素时 ,TPO无明显表达 (0 .1 μg/L) ;当培养基中加入 2 mg/L强力霉素时 ,TPO表达明显增高 (1 0 .8μg/L) .TPO表达水平与强力霉素浓度有关 ,随强力霉素浓度增高 ,TPO表达增加 .TPO表达水平还与强力霉素作用时间有关 ,加入强力霉素 6 h后 ,TPO表达明显增加 (1 .2μg/L) ,随培养时间延长 ,TPO表达增加 ,2 4 h达到峰值(1 0 .8μg/L) ,而且这种诱导作用是可逆的 .为进一步进行 TPO基因表达调控的体内研究奠定基础 ,有望为

视网膜色素上皮细胞脱离体外培养条件后细胞保存液的研究

目的研究人视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)离体或脱离体外培养条件后,维持细胞活性、且延长细胞存活时间最适宜的液体。方法将5代以上hRPE细胞(本实验室保存)按常规冷冻、复苏培养于DMEM/F12培养基添加10%胎牛血清,EGF20μg/L和bFGF20μg/L条件下,至80%以上汇合,经胰蛋白酶消化,收集细胞、计数,置于6种不同保存液中(平衡盐液、Quinn’sadvantage medium、生理盐水、18氨基酸液、5%葡萄糖液和人工脑脊液),用Annexin V/FITC Kit染色,利用流式细胞术(FACS)检测细胞死亡或凋亡。采用2h至8h之间3个时间点,检测hRPE细胞在6种不同细胞保存液中的细胞状态。结果室温状态下,hRPE细胞30min内均发生坏死。4℃状态下,2h平衡盐液组凋亡率最低(0.9%);各组分别与平衡盐液组相比,显示人工脑脊液组与平衡盐液组之间存在显著差异;4h至8h,hRPE细胞凋亡率从26.74%上升至41.36%。各组总死亡率与凋亡率基本一致。结论4℃状态下,6种溶液中,平衡盐液是维持hRPE细胞脱离培养条件后保持细胞活性,且延长细胞存活时间最适宜的溶液。

碱性成纤维细胞生长因子和环磷酸腺苷对神经前体细胞内源性端粒酶反转录酶基因转录水平的调控

目的探讨人类神经前体细胞中内源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的转录活性及增殖与分化相关调控机制。方法采用系列hTERT基因启动子的荧光素酶报告载体和β-半乳苷酶表达载体,瞬时共转染HeLa细胞和hNPCs-G3细胞,检测不同长度启动子的活性。分析碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进增殖过程中hTERT基因启动子活性,分析cAMP诱导分化过程中hTERT基因启动子活性。结果 hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,主要依赖近端启动子区。bFGF上调hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,其调控主要作用在-2 098～-1 099bp区域和-3 216bp～-2 098bp区域内;cAMP抑制hNPCs-G3神经前体细胞hTERT基因的转录,其调控主要作用在近端启动子区。结论神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,bFGF可上调神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,cAMP则可抑制hTERT基因的转录。

白细胞介素-1β诱导大鼠视网膜单核细胞趋化蛋白-1mRNA表达的研究

目的 探讨白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）对大鼠视网膜单核细胞趋化蛋白（ＭＣＰ）－１ｍＲＮＡ表达的诱导作用。方法 ２４只ＳＤ大鼠，右眼为实验眼，左眼为对照眼。实验眼玻璃体内注入ＩＬ－１β ２５０ Ｕ／５μｌ，对照眼注入等量生理盐水（ＰＳＳ）。注射后４，２４ｈ取视网膜组织，提取总ＲＮＡ应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测视网膜ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ表达。结果 眼内ＩＬ－１β注射后４ｈ实验眼视网膜ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ表达水平较对照眼明显增加；２４ｈ实验眼视网膜ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ水平与对照眼相近。结论 视网膜ＭＣＰ－１ｍＲＮＡ可被眼内ＩＬ－１β诱导表达，ＭＣＰ－１可能在ＩＬ－１β诱发的眼内炎症反应中发挥作用。

细胞因子对血小板生成素及其受体的调控

目的：探讨细胞因子对血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）及其受体表达水平的调控方式。方法：Ｆｅｕｌｇｅｎ染色结合图像分析测定ＨＥＬ细胞ＤＮＡ含量的变化，细胞传感器检测ＴＰＯ与其受体ＭＰＬ的特异结合，非放射性同位素细胞原位杂交法检测ｃｍｐｌ，ｔｐｏｍＲＮＡ。结果：ｒｈＴＰＯ使ｃｍｐｌｍＲＮＡ下调，ＩＬ３使ｃｍｐｌｍＲＮＡ上调，ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）使ｃｍｐｌｍＲＮＡ下调；未发现ｒｈＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ影响ｔｐｏｍＲＮＡ的转录。

含重组人血小板生成素基因的小鼠成纤维细胞的克隆筛选与鉴定

获取稳定表达重组人血小板生成素的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞克隆，为开展成纤维细胞介导的ＴＰＯ基因治疗研究提供细胞学基础。方法：以重组人ＴＰＯｃＤＮＡ为目的基因，构建真核细胞表达重组体ｐｃＤＮＡ３／ＴＰＯ，脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经Ｇ４１８筛选，获得稳定表达重组人ＴＰＯ的细胞克隆，应用ＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术鉴定目的基因的导入及表达。

人血小板生成素重组载体的构建与体外表达

应用基因克隆技术，以人ＴＰＯｃＤＮＡ为目的基因，构建真核细胞表达重组体ＶＲＴＰＯ，藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞，应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术对其转染及表达情况进行鉴定．结果表明：ＶＲＴＰＯ构建成功，在ＮＩＨ３Ｔ３细胞可表达人ＴＰＯ。