脑胶质瘤p16基因转染对细胞生长及放射敏感性的影响

目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法 将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，免疫组化检测p16基因表达，用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果 转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法采用脂质转染的方法．将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１，观察ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用，并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒ＰＣＤＮＡ３为对照。免疫组化、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｐ１６基因表达，对转染后细胞生长情况、细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ，ＣＤＤＰ）敏感性的变化进行分析。结果外源ｐ１６基因的高水平表达显著掏了胶质瘤Ｕ２５１细胞的生长，克隆形成率减少，克隆形成率减少，肿瘤细胞发生了Ｇ１期阻滞，同时，细胞对顺铂的敏感性降低，化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，同时降低Ｕ２５１细胞对顺铂的化疗敏感性。ｐ１６基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。

p16基因的不同转染方法对脑胶质瘤细胞的不同作用

目的 :探索 p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。方法 :分别采用脂质体、磷酸钙 +DMSO休克转染的方法 ,观察外源野生型 p16基因短暂转染与长期稳定转染对人胶质瘤细胞系U2 5 1、SWO的作用 ,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒PCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达 ,对转染后细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的变化进行分析。结果 :p16基因短暂转染有明显的凋亡诱导作用 ;而p16基因长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用 ,但外源 p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U2 5 1、SWO细胞的生长 ,克隆形成率减少 ,肿瘤细胞发生了G1期阻滞。结论 :外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的异质性特点与 p16基因转染后的“自然选择”

p16基因对脑胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响

目的 :探讨p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞对鬼臼噻吩苷、顺铂化疗敏感性间的关系。方法 :将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U2 5 1,观察p16基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用 ,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒PCDNA3为对照。Northern杂交检测p16基因表达 ,对转染后细胞生长情况、细胞周期、裸鼠致瘤能力的变化及细胞对鬼臼噻吩苷和顺铂敏感性的变化进行分析。结果 :外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U2 5 1细胞的生长 ,克隆形成率减少 ,肿瘤细胞发生了G1期阻滞 ,同时 ,细胞对鬼臼噻吩苷和顺铂的敏感性降低 ,其诱导的凋亡细胞数减少。结论 :外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖 ,同时抑制了鬼臼噻吩苷和顺铂对U2 5 1细胞的诱导凋亡作用进而降低了U2 5 1细胞对鬼臼噻吩苷和顺铂的化疗敏感性。

p16基因对脑胶质瘤细胞作用的实验研究

目的 探索 p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及 p16基因在脑胶质瘤临床诊断、治疗中的应用前景。方法 采用脂质体转染的方法 ,将外源野生型 p16基因导入胶质瘤细胞株 U2 5 1、C6 ,筛选阳性克隆。同时以空载体质粒 p CDNA3为对照 ,免疫组化检测 p16基因表达 ,用MTT法测定瘤细胞生长曲线及对转染的瘤细胞在裸鼠体内形成瘤块的变化进行分析。结果 转染 p16基因的 U2 5 1、C6细胞有外源 p16基因的整合及表达 ,克隆形成率减少 ,生长速度明显减慢 ,瘤细胞在裸鼠中形成瘤块体积显著降低。结论 导入外源野生型 p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖。

p16基因抑制脑胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡

目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞凋亡的关系。方法 采用脂质体、磷酸钙+DMSO休克转染的方法,分别将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、SWO,观察p16基因短暂转染与长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达,对转染后细胞生长的抑制、细胞周期、凋亡及裸鼠致瘤能力的变化进行分析。结果 外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251、SWO细胞的生长,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了G_1期阻滞。p16基因短暂转染可诱导胶质瘤细胞凋亡,而长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用。结论 外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。

转基因动物技术在脑胶质瘤研究中的应用进展

转基因动物技术是生命科学研究中的一个全新研究技术。通过这一技术,能在个体水平从时间、空间角度同时观察基因表达功能和表型效应,有效地将基因水平、蛋白水平和临床水平的研究有机地统一起来,显示了良好的运用前景。本文简要介绍了转基因动物技术的基本原理、方法和相关的分子生物学特性,以及它在胶质瘤研究领域中的运用。

人脑胶质瘤组织全长cDNA文库的快速构建与鉴定

目的采用SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术,快速构建高质量的人脑胶质瘤组织全长cDNA文库。方法提取多份人脑胶质瘤组织标本的总RNA,混合后处理得到纯化的mRNA,利用CDSⅢ/3'PCR引物(含SfiⅠB酶切位点)反转录,用SMARTⅣOligo(dT)(含SfiⅠA酶切位点)作为mRNA5'端延伸出去的模板,合成多出一段SMARTⅣOligo(dT)互补序列的cDNA第一链,进而以此序列为引物合成全长的双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ(A&B)酶切后克隆入经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体,再经噬菌体包装蛋白包装成为cDNA文库。结果获得2.4×106个重组子,重组率达100%,文库扩增后,滴度达4.5×109 pfu/ml,插入cDNA平均长度为1.2kb。结论成功构建高质量的人脑胶质瘤组织全长cDNA文库,为进一步筛选、克隆人脑胶质瘤抑癌基因及特异性表达基因奠定基础。

中西医结合综合康复疗法治疗持续性植物状态的疗效观察

目的探讨中西医结合综合康复疗法对持续性植物状态患者的治疗作用。方法选择符合持续性植物状态诊断标准的患者19例,进行催醒中药、脑循环代谢改善药、高压氧、电刺激等综合治疗。结果19例患者中基本痊愈4例(21.1%),明显好转5例(26.3%),好转8例(42.1%),总有效率为89.5%。结论持续性植物状态患者采用中西医结合综合康复疗法治疗可取得显著疗效。

成年大鼠纹状体神经干细胞的体外培养及分化

目的探讨成年大鼠纹状体神经干细胞多向分化的可能性。方法分离成年大鼠纹状体神经干细胞,单克隆连续传代培养并诱导分化,将分化产物进行免疫细胞化学染色及RT-PCR检测分析。结果无血清单克隆培养时期可见大量的细胞团出现,以血清诱导分化后出现多种细胞类型,免疫细胞染色发现分化细胞中有Nestin阳性、NSE阳性、GFAP阳性细胞,RT-PCR法分析mRNA水平有脑因子-1、γ-氨基丁酸α-受体γ-亚单位、酪氨酸羟化酶及色氨酸羟化酶等基因的表达。结论成年大鼠纹状体内分离出的干细胞样细胞具有自我增殖和多向分化潜能。

血管内皮细胞生长因子介导的免疫毒素抗胶质瘤的体外实验研究

目的构建血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38)基因的真核融合表达载体,并研究其表达产物对U251细胞的影响。方法通过PCR获得本实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP,经酶切及DNA测序证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染293细胞,然后用RT-PCR及Elisa法检测VEGF165-PE38融合蛋白在293细胞的表达,并利用转染细胞后的培养上清体外测定VEGF165-PE38融合蛋白对U251的选择性细胞毒作用。结果酶切分析及DNA测序证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT-PCR及Elisa法检测证实重组基因可在293细胞表达。细胞转染上清对U251具有较强的细胞抑制效应。结论VEGF165-PE38融合基因构建,表达及其功能的初步研究,为进一步研究其对胶质瘤的靶向毒性及临床应用奠定基础。

尼莫地平增强HyTK/ACV自杀基因对脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 :探讨尼莫地平增强阿昔洛韦 (ACV)介导的转HyTK基因治疗诱导脑胶质瘤细胞的死亡方式及旁观者效应机制。方法 :构建含HyTK基因的逆转录病毒载体LNSHyTK ,并转染人脑胶质瘤BT32 5和SCW细胞。单用ACV和联合尼莫地平应用体外试验观察对BT32 5 tk和SCW tk的杀伤效果。同时应用转基因前和转基因后瘤细胞共培养观察其旁观者效应。结果 :低浓度尼莫地平联合ACV作用下转tk基因细胞的凋亡率明显高于单独使用ACV ,并明显提高旁观者效应。结论 :尼莫地平能增强HyTK ACV自杀基因对脑胶质瘤细胞的杀伤作用 ,为钙拮抗剂应用于转tk基因治疗提供了实验依据。

高温对血脑屏障内皮细胞紧密连接的作用及其机制

目的 探讨高温对血脑屏障内皮细胞间紧密连接的影响及其分子机制。 方法 利用内皮细胞与胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。采用Millicell-ERS系统检测血脑屏障模型的跨内皮阻抗 (transendothelialresistance,TER)。对内皮细胞间紧密连接采用银染的方法研究其结构的完整性。运用半定量逆转录 -聚合酶链式反应 (RT -PCR)及Westernblotting的方法分析高温作用后血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白 (zonulaoccluden 1,ZO - 1)与occludin的表达变化。 结果 4 3℃高温作用 2h后 ,体外血脑屏障模型TER均值由 (32 1.30± 5 8.5 9)Ω·cm2 下降至 (6 5 .6 7± 6 .0 2 )Ω·cm2 。同时 ,内皮细胞紧密连接完整性明显破坏 ,内皮细胞ZO - 1及occludin的表达水平明显降低。 结论 高温可以明显破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接的完整性 ,高温条件下内皮细胞ZO - 1与occludin表达水平的降低是血脑屏障热损伤的重要分子机制。

体外血脑屏障模型的建立

目的 利用内皮细胞系建立一套可靠、简便的血脑屏障体外研究方法。方法 采用内皮细胞系ECV304与星形胶质细胞体外接触共培养的方法,探讨共培养过程中内皮细胞系所表现的多种血脑屏障特点。结果星形胶质细胞可以诱导内皮细胞系形成紧密连接并产生较高的跨内皮阻抗(TER),于第10天可达321.3 Ωcm2;同时,在体外血脑屏障模型中ECV304可与胶质细胞建立终足联系并具有较多的线粒体及较少的吞饮泡含量等与生理条件下血脑屏障相似的超微特点。在细胞生物化学特性方面,体外血脑屏障模型具有较高的血脑屏障特征酶γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)与碱性磷酸酶(ALP)活性,可分别达(480.24±104.17)U/mg蛋白、(589.13±54.35)U/mg蛋白。结论在体外血脑屏障模型中ECV304问可以形成大量的紧密连接从而具有内皮细胞及其紧密连接这一血脑屏障机能与结构的主要基础。同时,在超微结构与生化特性方面,体外血脑屏障模型也有着与生理条件下血脑屏障相似的特点。ECV304细胞与星形胶质细胞的体外共培养可以作为研究血脑屏障结构与功能的一种可靠而简便的体外实验方法。

胶质细胞诱导内皮细胞系血脑屏障特点的实验研究

目的探索胶质细胞在血脑屏障形成中的重要意义,建立一套可靠、简便的血脑屏障体外研究方法。方法采用内皮细胞系ECV304与星形胶质细胞体外接触共培养的方法,探索星形胶质细胞对内皮细胞系多种血脑屏障特点的诱导作用。结果星形胶质细胞可以诱导内皮细胞系形成紧密连接并产生较高的跨内皮阻抗(transendothelial electricalresistance, TER),同时,内皮细胞系的血脑屏障特征酶γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, γ-GT)与碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , ALP)活性明显增强。结论星形胶质细胞可以诱导ECV304细胞产生紧密连接等血脑屏障特点,ECV304细胞与星形胶质细胞的体外共培养可以作为研究血脑屏障结构与功能的一种可靠而简便的体外实验方法。

p16基因对脑胶质瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的：探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及ｐ１６基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法：将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１、Ｃ６，筛选阳性克隆。同时以空载体质粒为对照，免疫组化检测ｐ１６基因表达．用ＭＴＴ法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果：转染ｐ１６基因的Ｕ２５１、Ｃ６细胞有外源ｐ１６基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，对辐射的敏感性增强。结论：导入外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。

重组血管内皮生长因子165-PE38融合基因的构建及其对人脐静脉内皮细胞的抑制作用

目的构建血管内皮生长因子（VEGF）基因和铜绿假单胞菌外毒素（PE38）基因的真核融合表达载体，观察其表达产物对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的影响。方法通过聚合酶链反应（PCR）获得VEGF165基因片段，通过HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pRB391质粒获得PE38基因，构建两融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP，转染293细胞后用逆转录（RT）-PCR及ELISA检测VEGF165-PE38融合蛋白在293细胞的表达，并检测转染细胞的培养上清对HUVECs的选择性细胞毒作用。结果成功构建VEGF165-PE38融合基因真核表达载体，其可在293细胞表达，ELISA检测表明空质粒转染组、无转染组和重组质粒转染组VEGF浓度分别为（269．0±23．6）、（306．0±29．3）和（1390．0±136．6）ng／L。CCK-8和TUNEL检测表明重组质粒细胞转染上清对HUVECs具有较强的细胞抑制效应，凋亡细胞率分别为8．34％、7．69％和39．88％，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论VEGF165-PE38融合基因构建，表达及其功能的初步研究，为肿瘤血管内皮细胞的靶向治疗及临床应用奠定了基础。