大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性。方法分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞。将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜。采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价。体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像。结果该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)。标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低。结论利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞。

荧光偏振方法快速检测HPV16 E7第29位密码子点突变

目的 :通过TDI FP方法检测宫颈病变组织中HPV1 6E7基因第 2 9位密码子突变 (A→G)并探讨其与宫颈癌的相关性 ,同时建立一种HPV点突变检测的新方法 .方法 :以 5 3例HPV1 6阳性宫颈组织为研究对象 .首先PCR扩增含待检测位点的靶基因片段 ,然后用TDI FP方法检测荧光素碱基的掺入情况 ,判断所研究位点的基因型 .结果 :宫颈浸润癌组织中HPV1 6E7第 2 9位密码子的突变率为 4 3.4 8%(1 0 / 2 3) ,对照组为 1 0 .0 0 % (2 / 2 0 ) ,病例组为 39.39% (1 3/33) ,组间突变率差异有显著性 (P <0 .0 5 ) .该法与随机抽查标本测序结果一致率为 1 0 0 % .结论 :本研究中HPV1 6病毒发生E7第 2 9位密码子突变的情况与其他地区相比存在差异 ;HPV点突变TDI FP检测方法是一种快速简便。

高危人乳头瘤病毒基因变异与宫颈癌的关系

近年来 ,高危人乳头瘤病毒 (HPV)基因变异和宫颈癌进展的关系日益受到重视。已经发现了一些可能对诊断和治疗有参考意义的基因变异。本文对高危HPV的重要变异与表达调控、细胞转化及永生化。

超顺磁性氧化铁对大鼠神经干细胞生物学活性的影响

目的初步研究利用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞来源的神经干细胞及其对细胞活力、增殖等生物学活性的影响,并确定最佳标记浓度。方法无菌条件下取大鼠股骨骨髓,梯度密度离心法分离得到骨髓基质细胞。体外培养、诱导成神经干细胞,使用不同终浓度的(6.25、12.5、25、37.5、50μg/ml)Ferumoxides(超顺磁性氧化铁)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等方法鉴定Ferumoxides标记神经干细胞的效率及对细胞活力、增殖等生物学特性的影响。结果Ferumoxides可以高效率标记神经干细胞,标记效率在90%以上。普鲁士蓝染色显示标记的神经干细胞胞质内存在细小蓝色铁颗粒,细胞呈淡蓝至深蓝色,颜色的深浅与所加Ferumoxides的剂量成正相关。电镜结果显示标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,主要集中在胞体上。当Ferumoxides终浓度高于25μg/ml时,Ferumoxides颗粒在细胞内聚集成团块状,量较多,在一定程度上影响了细胞超微结构的观察;低于25μg/ml时,Ferumoxides颗粒散布于细胞胞质内,并随着浓度的降低,Ferumoxides颗粒在胞质内分布越分散,量越少。MTT及流式细胞仪结果显示Ferumoxides终浓度大于25μg/ml时则对细胞活力、增殖、凋亡有一定影响,小于等于25μg/ml时对细胞活力、增殖无明显影响。结论利用Ferumoxides在体外标记神经干细胞是一种可行的实验方案,其最佳终浓度为25μg/ml。

宫颈癌与HLA等位基因DQB1＊03、DR15的相关性研究

目的 :探讨我国陕西地区宫颈癌的发生与人类白细胞抗原 (HLA) DQB1 0 3、DR15等位基因的相关性 .方法 :采用序列特异性引物的聚合酶链式反应 (PCR SSP)方法 ,扩增HLA等位基因DQB1 0 3、DR15的目的DNA片段 (分别为 79、197bp) ,分析两对等位基因在陕西地区宫颈癌患者和正常人中分布频率的差异 .结果 :4 5名宫颈癌患者组中DQB1 0 3等位基因频率显著高于 5 0名健康对照组 ,DR15等位基因频率在两组中的分布无显著差异 .结论 :HLA等位基因DQB1 0 3可能与宫颈癌的发生具有相关性 ,DR15可能与宫颈癌的发生不存在关联 .

复发尖锐湿疣患者感染人乳头瘤病毒基因型的荧光偏振检测

目的 检测复发尖锐湿疣患者的人乳头瘤病毒 (HPV)基因型 ,以探讨尖锐湿疣复发的机理 ,并指导治疗。方法 以蛋白酶K消化法提取 81例复发尖锐湿疣组织临床样本DNA ,以各型HPVDNA通用引物行PCR扩增 ,将荧光偏振检测技术与模板指导的末端延伸反应 (TDI FP)结合 ,应用HPV 6B ,11,16 ,18各型特异探针杂交延伸反应对扩增产物进行HPV分型 ,并分别以含HPV 6B ,11,16 ,18L1质粒的阳性及不含待测靶基因的同源质粒的阴性标准品为参照。结果 81例尖锐湿疣组织块中HPV检出率 10 0 % ,其中两型混合感染 2 9例 ,占 36 .6 % ,三型混合感染 7例 ,占 8.6 %。结论 本组 81例复发尖锐湿疣患者的HPV的多重感染率高达 4 5 % ,可能与该病的反复复发有一定相关性。

菲立磁标记兔骨髓基质细胞生物学特性的实验研究

目的初步探索利用菲立磁(FE)和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)体外磁性标记兔骨髓基质细胞(BMSC)这一方法的可行性,并确定其标记BMSC的最佳浓度。方法无菌条件下行股骨取髓,采用梯度密度离心法分离获取兔BMSC,体外培养、诱导分化为神经干细胞(NSC),使用不同浓度(5、12.5、25、37.5μg/ml)的FE-PLL标记BMSC。采用普鲁士蓝染色、CCK-8法、流式细胞仪、透射电镜、免疫细胞染色等方法,检测FE-PLL标记兔BMSC的效率及其对细胞生长、分化、凋亡的影响。结果FE可以高效率标记BMSC,被标记的细胞在显微镜下呈淡黄或深黄,颜色深浅与所加FE的剂量呈正相关。流式细胞仪结果显示:5、12.5、25μg/ml各组FE对细胞无不良影响,而37.5μg/ml组凋亡细胞明显增加。CCK-8测定的生长曲线表明:除37.5μg/ml组外,其他各组细胞之间差异无统计学意义。普鲁士蓝染色显示:各组FE-PLL标记BMSC胞质内均可见到细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示:各组FE-PLL标记的BMSC胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,其含铁囊泡的数量依FE浓度增加而增加。结论FE可以用来体外标记兔BMSC;其标记效率随FE浓度增加而增高,最佳浓度为25μg/ml。

应用TDI-FP技术分析宫颈癌组织HPV16 E7基因A647G点突变(英文)

模板指导的末端碱基掺入反应结合荧光偏振检测技术(templatedirectdye-terminatorincorporationwithfluorescence-polarization,TDI-FP)是SNP检测新技术.应用TDI-FP方法分析中国陕西HPV16阳性宫颈组织HPV16E7基因第647位核苷酸A→G热点突变(即A647G),首先在HPV16阳性的91例宫颈癌及49例正常/宫颈炎妇女宫颈DNA标本中,PCR扩增含647位点在内的HPV16E7部分基因,然后将紧邻647位点5′端的寡核苷酸探针与PCR产物内的模板杂交,并延伸一个与647位点碱基互补的荧光标记碱基:TAMRA-ddTTP或R110-ddCTP.用荧光偏振仪读取荧光偏振(FP)值,根据升高的相应FP值判断647位点碱基.结果表明,宫颈组织HPV16E7A647G的总体检出率为35.71%(50/140).宫颈癌组的A→G突变率为42.86%(39/91),显著高于正常/宫颈炎组22.45%(11/49)的突变率(x2=5.778,P=0.016),两组间的OR值为2.59(95%CI=1.17￣5.71).提示TDI-FP可用于HPV有意义点突变的分析;我国陕西地区妇女HPV16A647G突变率及其对宫颈癌的警示性与其他地区相比有明显差异,该地区携带此突变病毒株的妇女患宫颈癌的风险可能较高.

USPIO标记大鼠骨髓源神经干细胞体外磁共振成像研究

目的 应用磁共振成像技术（MRI）观察超小超顺磁性氧化铁（USPIO）欣诺（Sinerem）标记后的大鼠骨髓源神经干细胞体外成像情况.方法 分离大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成神经干细胞.以200μg/ml的浓度105个细胞用不同的自旋回波序列T1WI、T2WI与T2＊WI在2％的琼脂糖凝胶中模拟在体环境分别行4.7T扫描确定最佳的扫描序列.将不同浓度（0、25、50、100、200、500μg/ml）Sinerem和干细胞共孵育培养过夜标记后置于2％的琼脂糖凝胶中,以自旋回波序列T2＊WI磁共振干细胞成像;并在磁共振下观察不同数量细胞200 μg/ml Sinerem标记细胞（101个,102个,103个,104个,105个）的信号情况.观察细胞在浓度200 μg/ml（106个）标记时经长期培养不同时间点时的信号变化.结果 MRI扫描结果提示序列T2＊WI扫描的敏感性最强.不同浓度的Sinerem标记细胞的磁共振信号强度不同,随着Sinerem浓度的升高MRI信号呈降低趋势,浓度为500 μg/ml时信号强度最低,肉眼观察可看到浓度100 μg/ml以上标记细胞的MRI的信号强度明显低于对照样品,可进行区分.标记细胞数量达103个及以上时在磁共振下其信号变化能被观察到.106个标记细胞的信号随培养时间的延长逐渐增加,4w时仍能在磁共振下显示可区分的低信号.结论 利用Sinerem标记的骨髓源神经干细胞体外可在MRI下呈现可视区别的低信号影,T2＊WI序列是最敏感的序列;信号强度的高低可用于评估标记细胞的数量.Sinerem标记的细胞可用于磁其振下讲行长期的示踪.

外源性绿色荧光蛋白和蛋白酪氨酸激酶受体B基因在大鼠骨髓源性神经干细胞内稳定表达的检测特征

目的:利用本实验室构建的携带蛋白酪氨酸激酶受体B基因的荧光真核表达质粒-pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B,转染大鼠骨髓基质细胞源性的神经干细胞,观察其在神经干细胞中的表达情况。方法:实验于2005-06/2006-06在南方医科大学珠江医院神经医学研究所完成。实验选用SD大鼠进行骨髓的采集及骨髓基质细胞的获取,培养1周后得到较纯化的骨髓基质细胞,进行细胞传代培养,传代培养的细胞加入10%胎牛血清及维甲酸以诱导骨髓基质细胞向神经干细胞分化。细胞培养2周后,pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B经LIPOEECTAMINE.2000脂质体转染培养的大鼠骨髓基质细胞源性的神经干细胞,24h后观察绿色荧光蛋白的瞬时表达情况,以酶切和测序鉴定质粒的正确性,凝胶电泳鉴定PCR产物大小,应用免疫组化定量分析法检测转染该质粒的细胞中蛋白酪氨酸激酶受体B的含量,并与正常细胞作比较。结果:①细胞转染24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达,表达率约18.1%,随着培养时间的延长,表达绿色荧光蛋白的细胞数量逐渐增多,于1周左右达到高峰,表达率约42.8%,继续观察1个月未发现荧光表达减弱。②酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性,扩增的PCR产物凝胶电泳结果与设计引物间的片段大小1461bp完全一致,转染细胞电泳未见目的条带。③免疫组化结果表明,所有细胞均含有蛋白酪氨酸激酶受体B抗原成分,转染pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B的细胞该抗原成分较未转染细胞明显增加(19.76±3.98,32.17±6.29,P<0.05)。结论:LIPOEECTAMINE.2000是一种简单而高效的转染大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞的方法,转染的pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B基因在细胞内可以稳定表达,增强型绿色荧光蛋白可以作为该基因表达的标记。

高危人乳头瘤病毒58型E6基因的克隆及表达

目的 :获得含人乳头瘤病毒 (HPV) 5 8型E6基因的克隆及表达重组体并体外表达E6蛋白 .方法 :聚合酶链方法从 1例宫颈腺癌患者癌组织DNA中获得HPV5 8E6基因 ,并将其与克隆载体pGEM TEasy连接 ,获得重组体HPV5 8 E6 pGEM T ,继之以双酶切将E6基因与同样双酶切的线性化的pRSET A表达载体连接 ,得到E6表达重组体pRSET 5 8E6 ,转化E .coliBL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达 .结果 :从 1例宫颈癌患者中成功获得了少见HPV5 8型的E6基因并构建了其重组表达载体 .经IPTG诱导后可表达Mr2 4 0 0 0的 6HisHPV5 8E6融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的 1 0 % .结论 :成功获得了少见HPV5 8高危型的E6基因 ,并可在E .

Sinerem纳米铁标记大鼠骨髓源神经干细胞移植入脑缺血卒中大鼠脑内的磁共振示踪研究

目的:将Si ner em纳米铁标记的神经干细胞移植入缺血卒中模型大鼠脑后,观察其在大脑中的存活、迁移和整合情况。方法:体外分离大鼠骨髓基质细胞并培养诱导分化为神经干细胞,用Si nerem纳米铁标记干细胞后,将标记细胞定向移植入缺血卒中模型大鼠纹状体内。在不同时间点(1天、1周、2周、4周)行4.7T磁共振成像示踪,用组织学方法观察标记细胞在脑内的转归情况。结果:卒中缺血模型中,移植到纹状体部位的标记细胞磁共振扫描时呈低信号区,1周时可见低信号区开始向对侧方向迁移,随时间的增加至2周时迁移至胼胝体纤维,4周时进一步沿胼胝体向缺血侧迁移。组织学检测可见移植的标记细胞普鲁士染色阳性,标记细胞的分布与磁共振扫描的低信号区相一致。结论:Si nerem标记的神经干细胞在动物活体内能在磁共振下显像,其在脑内存活、迁移可被磁共振特异性示踪,可用于干细胞移植的无创监测。

Sinerem标记大鼠骨髓基质细胞及移植后活体示踪研究

目的初步探索利用欣诺(Sinerem)和转染试剂体外磁性标记大鼠骨髓基质细胞这一方法的可行性,为将来临床上应用MRI追踪标记细胞奠定基础。方法无菌条件下行股骨取骨髓,梯度密度离心法分离获取大鼠骨髓基质细胞,使用Sinerem-多聚赖氨酸复合物(SE-PLL)标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色、电镜和台盼蓝排除实验等方法鉴定SE-PLL标记大鼠骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并对SE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。将SE-PLL标记和未标记后的骨髓基质细胞分别移植入大鼠左右侧尾壳核脑内,细胞移植后1、4、7w应用MRI对脑内移植的细胞进行活体示踪,最后利用组织切片进行普鲁士兰染色。结果Sinerem可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。普鲁士蓝染色显示SE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示SE-PLL标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。与正常未标记的细胞相比较,SE-PLL标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变,与组织学切片结果基本一致。结论以上结果提示Sinerem可以用来体外标记骨髓基质细胞,利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。

跨世纪消化病学医师的继续教育

近年来,随着医疗保健、医学新技术和人们思想行为的不断变化,对临床医师也提出了更高的要求。今天的消化病医师面对的挑战有来自科学飞速发展带来的新技术的应用,如计算机、网络通讯、分子生物学诊疗技术,管理需要的领导能力。也有早已存在却有了新的特点的问题,如医患之间的交流、医疗保健的经济效益、考试形式的更新等。因此,肩负重任的跨世纪消化病医师要适应新的形势,就必须以教育为突破口,改变教育中存在的不足,与现代科技发展相接轨,以获取新的知识和技能,提高整体水平。

路虎揽胜时速180km/h受限

车型：揽胜。行驶里程：100100km。故障现象：客户反映该车发动机仪表上亮了一个黄色的符号,然后就跑不起来了,当时车速是180km/h,使劲踩加速踏板车子从怠速一直往上加速就是跑不起来。有时问题出现时车子最高能跑到100km/h。故障诊断：接车后验证故障现象,未见故障灯亮,发动机加速也正常。与客户沟通先出去试车,看看到底是什么故障。于是由客户开车去高速上试车。之前开了很长时间问题都没有出现,经客户介绍车子不上180km/h问题是不会出现的。

路虎揽胜无法启动

车型：揽胜，5．0L。行驶里程：90100km。故障现象：客户反映发动机仪表上亮了好多灯，然后就打不着车了，启动也没有反应。

USPIO标记大鼠骨髓源性神经干细胞移植脑皮层影像及形态学初步研究

目的将超小超顺磁性氧化铁（USPIO）Sinerem标记的大鼠骨髓源性神经干细胞移植鼠脑后，初步观察其在大脑中的活性、迁移和整合情况，确定MRI成像示踪Sinerem标记神经干细胞的可行性。方法分离SD大鼠骨髓基质细胞，体外培养诱导成骨髓源性神经干细胞。将Sinerem氧化铁和神经干细胞共孵育培养过夜。采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况。将标记细胞立体定向移植微注射到大鼠脑皮层。在不同时间点以SE序列T2WI行4．7T磁共振干细胞成像示踪，然后用组织学方法观察标记细胞在脑内的转归情况。结果Sinerem标记神经干细胞效率为98％～100％，普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中，电镜显示铁颗粒集中于内涵体／溶酶体中；移植细胞体内的T2WI信号强度明显降低．可在4周时检测到细胞沿胼胝体迁移；组织学检测结果表明标记后的细胞可在脑内存活，并能沿神经纤维迁移。结论USPIO能有效地标记骨髓源性神经干细胞，利用磁共振成像可进行大脑中活体示踪监测。

干细胞移植治疗脑胶质瘤的研究进展

尽管脑胶质瘤的治疗取得不断的进步，但其致残率和死亡率仍很高，其难以根除的主要原因是肿瘤细胞对脑组织的高度浸润性。传统的外科手术辅助放疗、化疗方法对正常神经组织的破坏及副作用很大，如放射性坏死、认知障碍和脑白质病等。近几年随着干细胞技术的兴起，利用干细胞作为载体的脑胶质瘤基因治疗受到广泛关注，该治疗方法的优势在于既能除去肿瘤细胞又有组织修复功能。本文就干细胞治疗神经胶质瘤的细胞来源、肿瘤趋向性、治疗机理及体内监测等方面的现状及进展进行简要回顾和展望。

宫颈癌组织HPV58的检测及其E7基因的克隆和表达

目的 检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒 5 8型 (HPV5 8)并克隆表达其E7基因。方法采用GP5 +/GP6 +引物系统扩增 5 8例宫颈癌组织 ,将荧光偏振 (FP)检测技术与模板指导的末端延伸反应 (TDI FP)结合 ,检测HPV5 8,确定HPV5 8感染阳性宫颈癌组织。用特异引物从HPV5 8阳性标本中扩增HPV5 8早期表达蛋白E7基因 ,将其连入pGEM TEasy载体 ,获得克隆重组体HPV5 8E7 pGEM T ,并测序验证。将E7基因与pRSET A融合表达载体连接 ,获得E7表达重组体pRSET 5 8E7,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,并用IPTG诱导表达。结果 5 8例宫颈癌标本中 ,HPV5 8阳性 10例 ,占 5 2例HPV阳性标本的 19.2 %。从其中扩增到了HPV5 8E7基因并构建了其克隆和表达重组体。其表达重组体经IPTG诱导后 ,可表达Mr16× 10 3 的HPV5 8E7His6融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的 30 %。结论 欧美国家少见的高危HPV5 8在中国陕西人宫颈癌组织中并不少见。HPV5 8E7重组表达体可在大肠杆菌中高效表达 ,为HPV5

线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的改进

目的研究一种稳定、简便的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型制作方法。方法采用健康SD雄性大鼠,线栓法制作局灶性脑缺血再灌注损伤模型,结扎颈总动脉(CCA)及颈外动脉(ECA),不结扎翼腭动脉,用5-0头皮针于CCA结扎的远端刺一小口捅入栓塞线造成缺血,拔出线栓形成再灌注。通过神经功能缺损评分、红四氮唑(TTC)染色和病理学检查等方法评价该模型的可靠性。结果动物麻醉后一般只需15 min左右即可完成手术,术后大鼠神经功能缺损明显,TTC染色示脑梗塞区苍白,病理学检查显示典型病理表现。结论该方法缺血效果明确可靠,术式简便,手术时间短,不需具备显微手术操作技巧,是一种理想的制作局灶性脑缺血再灌注损伤模型的方法。