核苷酸焦磷酸酶15基因多态性检测用于预测硫唑嘌呤相关白细胞减少的快速卫生技术评估

目的 评价核苷酸焦磷酸酶15(NUDT15)基因多态性检测预测硫唑嘌呤相关白细胞减少(TIL)的准确性、敏感性、特异性和经济性,为临床决策提供循证依据。方法 系统检索PubMed、Cochrane图书馆、中国国家知识基础设施(CNKI)、万方数据库、维普中文科技期刊数据库(VIP)等数据库以及多个卫生技术评估(HTA)机构官网,纳入有关TIL的基因多态性检测的HTA报告、系统评价或Meta分析以及经济学研究,并对这些证据进行质量评估。对准确性、敏感性、特异性结果进行定量描述,对经济学评价结果进行定性描述。结果 共纳入文献9篇,其中Meta分析文献7篇、经济学文献2篇。在东亚、南亚以及美洲,rs116855232突变率高,纳入的研究中该位点的突变率11.07%~40.52%。与对照组比较,rs116855232突变组(TT/TC)发生白细胞减少的风险大大高于非突变组。2项研究报道了NUDT15基因多态性检测预测TIL的敏感性和特异性,得出了近似的敏感性分别为0.432,0.413,特异性分别为0.917,0.89。在经济性方面NUDT15联合硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)相比单独筛查TPMT具有成本-效果优势。结论 基于现有证据,rs116855232是TIL的临床相关预测因子,相比TPMT具有更高的准确性、灵敏性和特异性。与单独对进行TMPT筛查相比,联合筛查NUDT15和TPMT缺陷等位基因具有经济性。

指数线性聚合酶链式反应法制备焦磷酸测序反应的单链模板

建立了一种简单的焦磷酸测序用单链模板制备方法,以包含SNP6位点一段78bp序列为对象,采用非热启动Taq酶进行指数线性PCR扩增,通过加入甘油、BSA等PCR增强剂增加反应的效率和特异性,设计反应液A和B处理PCR产物中干扰焦测序的限制性引物、未完全反应的产物、焦磷酸和dNTPs等杂质,处理后1～2μLPCR产物就可直接用于焦测序检测。测定了BRCA1基因中5个乳腺癌相关的SNP位点,获得的图谱无非特异性信号,测得序列与参考序列一致,能够进行SNP分析,表明本方法可以制备高质量焦测序单链模板,且使焦测序的成本显著降低,操作更为简便,减少了操作过程中样本间的交叉污染,有利于焦测序样品预处理的自动化。

动物血中血红蛋白多肽开发利用的研究进展

我国拥有丰富的动物血资源,但是由于其血腥味重、适口性差、难消化等原因,动物血并没有得到真正的利用。随着近年来科学技术的发展,一直制约动物血资源开发利用的问题得到了解决,动物血的开发向高值化转变。动物血中含大量的蛋白质,尤其是血红蛋白(Hb),因此,开发Hb生物活性肽前景十分广阔,经济效益巨大。本文综述了Hb的分离纯化及其理化性质和Hb多肽的制备及其分离纯化的方法,并探讨了Hb多肽在饲料工业、医药工业以及食品工业的利用现状,最后提出了Hb多肽存在的问题以及开发利用的方向。

全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用"HpH Buffer"直接扩增全血模板,仅需1μL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测序,经过条件优化,仅需5μL扩增产物和1μL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为临床基因多态性检测提供了一种操作简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶的个体化用药。

试剂采购管理系统的实现

目的:提高试剂采购效率,使采购信息的数据管理更加合理。方法:经过详细的需求分析后,用Delphi设计前台界面,SQL Server进行后台数据库设计,两者结合进行编程实现。结果:该系统既能完成对试剂采购信息数据的高效管理,又实现了试剂采购的自动提醒和结合Microsoft Word进行打印等实用功能。结论:该系统完成了设计目标,实现了试剂采购过程产生的大量数据的高效管理和特定功能。

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因,将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK,将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导,重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析,重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后,重组PPDK蛋白基本达到电泳纯,并被成功应用于焦测序中。

卡马西平所致不良反应49例临床特点及防治对策

目的分析卡马西平所致不良反应的特点，为临床合理用药提供依据。方法对该院2005-2015年49例应用卡马西平后出现不良反应的病例，分别从患者的年龄、性别、原患疾病、不良反应类型、合并用药情况、不良反应的转归、基因检测等方面进行分析。结果50岁以上的中老年患者比例高于其他年龄组；卡马西平治疗的原患疾病中，各种神经性疼痛最多（69．38％），其次为癫痫（26．53％）；皮肤不良反应最多（95．92％）；合并用药更易导致严重的药物不良反应（8例／10例）；HLA－B＊1502等位基因检测阳性率高（93．75％）。结论卡马西平所致的不良反应危害大，中老年患者应从低剂量开始给药，减少合并用药，加强用药监护，监测药物浓度，使用该药前最好进行 HLA－B＊1502等位基因检测，从而促进临床安全合理用药。

药物基因检测指导的氯吡格雷个体化用药2例

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者经皮冠状动脉(冠脉)介入治疗(PCI)围手术期有效的抗血小板治疗十分重要,患者虽接受规范氯吡格雷联合阿司匹林双联抗血小板治疗,但仍可发生支架内血栓事件。氯吡格雷治疗后血小板残留高反应性(HRPR)为PCI后支架内血栓和主要心血管不良事件的主要原因之一[1]。研究表明,细胞色素P450 2C19(CYP2C19)基因多态性是冠心病患者口服氯吡格雷疗效及预后欠佳的主要影响因素[2]。因此个体化抗血小板治疗时,应对患者进行基因型检测,尽早识别血小板高反应人群,更换治疗药物或增加氯吡格雷剂量,可降低患者支架内血栓形成风险。

杂景天愈伤组织诱导及红景天苷测定

以杂景天的子叶、胚轴为外植体,接种在附加不同激素组合的MS培养基上诱导愈伤组织产生,愈伤组织经继代培养后,用高效液相色谱检测红景天苷含量.结果显示,杂景天的子叶是诱导愈伤组织的理想外植体,子叶在MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D和MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA培养基上的愈伤组织诱导率较高(81.8%、80%).愈伤组织有红、绿2种类型.HPLC检测显示红色愈伤组织不含红景天苷,绿色愈伤组织红景天苷含量为0.288 6%.表明利用组织培养生产红景天苷是可行的.

高新技术企业在供给侧改革中的作用与政策建议

供给侧改革是我国经济发展迈入新常态的首要课题,企业作为供给端主体,必须通过科技创新扩大有效供给,实现供给端结构优化。高新技术企业相比其他企业而言,拥有大量核心自主知识产权、创新能力强、成长性高,可以有效带动传统产业转型升级、引领新兴产业发展壮大,高效解决供需结构错配问题,实现经济长期可持续增长。

高通量水凝胶芯片检测Y染色体微缺失方法的建立

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、低成本的通用水凝胶芯片检测平台,用于临床筛查Y染色体微缺失。方法:以含公用序列的特异性延伸引物对检测位点进行延伸,延伸过程中Cy5-dUTP的掺入使产物被标记上荧光,再与丙烯酰胺修饰公用探针杂交将延伸产物固定于水凝胶芯片上,电泳去除游离的Cy5-dUTP后进行荧光扫描分析,并优化水凝胶芯片检测方法的条件。结果:采用水凝胶芯片检测方法对9例样本的SY254位点检测,检测结果为3例正常,6例微缺失(1例女性样本作为阴性对照),与传统的PCR-电泳检测结果一致。结论:初步建立了一种检测微缺失的水凝胶芯片平台,为Y染色体微缺失的诊断提供了新技术,提高了男性不育的诊疗水平。

单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒

建立了单管逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。针对甲型H1N1流感病毒的M基因和HA基因的保守区,设计了两组特异性引物,分别用于筛选甲型流感病毒及鉴定甲型H1N1流感病毒。对反应体系中的关键因素进行优化,反应结果可直接通过浊度或者SYBR GreenⅠ荧光进行判定。本方法最低可检测到10拷贝/管的甲型H1N1流感病毒。为验证方法的可行性,对30例临床样本进行了检测,与美国疾病控制与预防中心(CDC)的TaqMan方法进行对比,检测的灵敏度和特异性分别为92%和100%。本方法实现了单管快速检测甲型H1N1流感病毒,为甲型H1N1流感病毒的现场检测提供了新方法。

生物素化荧光素酶的克隆表达及其固定化研究

为了在体内实现萤火虫荧光素酶的生物素酰化修饰,将大肠杆菌中编码生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)C端87个氨基酸的功能域基因融合到萤火虫(Pyrocoelia pectoralis)荧光素酶cDNA的末端。经大肠杆菌生物素合成酶(biotin holoenzyme synthetase)的催化,生物素与BCCP上特定的赖氨酸(Lys)残基共价结合,由此与BCCP融合的萤火虫荧光素酶间接实现了生物素化的修饰。利用生物素与配体亲和素或链霉亲和素的特异性耦合,可以将荧光素酶固定到亲和素或链霉亲和素包被的磁珠上,从而使荧光检测的应用更加灵活和方便。讨论了生物素化荧光素酶的克隆、表达以及功能检测。

三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究

目的比较不同核酸共提取试剂盒对血液病毒的提取效能差异。方法选择国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒,分别为OMEGA试剂盒、QIAGEN试剂盒和WATSON试剂盒,HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV阴性血清样本均取自南京军区南京总医院。样本核酸提取按照各试剂盒说明书进行操作,定量方法采用实时荧光定量PCR。结果 OMEGA试剂盒对DNA的提取效率最高,对RNA的提取效率最低,耗时最短,成本居中;QIAGEN试剂盒DNA和RNA提取效率均较高,耗时居中,成本最高;国产WATSON试剂盒对DNA或RNA提取效率居中,耗时最长,成本最低。结论不同试剂盒对血液病毒的提取效能各不相同。对于已知病毒载量和病毒种类的样本,根据提取液DNA浓度和RNA浓度选择试剂盒;而对于未知病毒载量和病毒种类的样本,首选QIAGEN试剂盒,其次可选WATSON试剂盒。如只考虑成本,则首选WATSON试剂盒。

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP")。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。

焦测序技术的研究进展

焦测序技术是一种实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将焦磷酸转化为等量的荧光信号,通过荧光信号的高低实时检测待测序列,操作简便,可实现高通量、自动化测定,检测不需要电泳,不需要对样品标记和染色,结果准确可靠重复性好。本文综述了焦测序技术的基本原理、历史及其在测序模板制备技术、反应体系和检测仪器三个方面的最新进展,并重点介绍制备单链的Late-PCR技术、高灵敏度反应体系的获得以及454公司超高通量测序技术,并对焦测序技术的发展做了展望。

新一代测序技术的研究进展

大规模DNA测序技术是揭秘人类和其它生物遗传密码的重要技术,在分子生物学和基础医学领域有广泛应用。第二代测序技术的出现使DNA测序的通量大幅提高,测序的成本大幅下降,原来只有在大型测序中心才能完成的测序任务现在已经可以在更多的实验室展开。但是,早期的第二代测序技术仍然存在诸如文库构建过程复杂、测序成本依然较高等缺点。为了克服上述缺点,近三年发展了几种新的第二代和第三代测序技术,这些技术不仅继承了早期第二代测序技术通量高的优点,而且在文库构建等方面取得了重要突破,进一步简化了测序操作,降低了测序成本,缩短了测序时间。本文就几种最新的大规模测序技术的原理、特点与发展趋势进行简要介绍。

循环肿瘤DNA突变检测方法研究进展

循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)含有肿瘤的遗传信息,与肿瘤组织具有高度的一致性,可代替肿瘤组织用于肿瘤的早期诊断,预后监测和药物疗效监测,是一种具有良好临床应用前景的液体活检标记物。但血液中的ctDNA片段化程度高,含量稀少,且与野生型DNA混合存在(约1%甚至更低),并会随着患者肿瘤分期等情况动态变化,造成了ctDNA检测困难,需要高灵敏度高特异性的突变检测方法,才能够从大量的野生型DNA中检测出微量突变型ctDNA。目前,灵敏度和特异性能够满足ctDNA检测需求的方法主要有扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)、钳制PCR(Clamping-PCR)、数字化PCR(Digital-PCR)、西格诺公司的质谱分辨技术(Sequenom UltraseekTM)和高通量测序技术。本文对这些方法的原理、特点、最新进展和应用前景进行了综述,为研究人员选择合适的ctDNA检测方法提供理论依据。

高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑浓度

目的:建立一种简单高效的高效液相色谱(HPLC)法用来检测人体中伏立康唑的血药浓度,并应用于临床中伏立康唑用药监测,以促进其个体化用药。方法:色谱柱:Kromasil C18(4.6 mm×150 mm,5μm),柱温:35℃,流速:1.0 mL·min^-1,流动相∶甲醇-水(60∶40),检测波长:257 nm,内标:酮康唑。对该方法进行方法学验证。结果:该方法专属性良好,血浆中伏立康唑在0.1~20.0μg·mL^-1范围内线性良好(r=0.999 6),定量下限为0.1μg·mL^-1。高、中、低3个浓度提取回收率分别为(90.68±10.32)%、(92.82±8.26)%、(97.47±4.58)%;日内精密度RSD分别为5.87%、7.85%、4.10%;日间精密度RSD分别为5.64%、3.30%、2.74%。对某院20例(男12例,女8例)使用伏立康唑抗真菌治疗的患者运用该方法进行了监测,结果显示浓度范围在0.71~13.51μg·mL^-1之间。结论:本方法专属性高,操作简便,结果准确,可用于临床上伏立康唑血药浓度的检测,从而促进其个体化用药的推广。

甲磺酸伊马替尼及其活性代谢产物血浆谷浓度对胃肠间质瘤患者中重度不良反应发生风险的预测价值

目的探讨甲磺酸伊马替尼(IM)及其活性代谢产物N‐去甲基伊马替尼(NDI)稳态血浆谷浓度(谷浓度)对胃肠间质瘤(GIST)患者中重度不良反应发生风险的预测价值及警戒值。方法研究对象选自2020年7月至2021年3月于苏州大学附属第一医院接受IM治疗的GIST门诊复诊患者。对入选患者当即询问并记录其相关临床信息以及入组前28 d内IM相关不良反应发生情况,于复诊当天采血(距上次服药22~24 h)测定IM及NDI谷浓度,并于采血后28 d电话随访IM相关不良反应发生情况;通过医院信息系统收集患者采血前、后各28 d内血常规和血生化检查结果。对不良反应进行因果关系判断和严重程度分级后,以未发生和发生Ⅰ级不良反应者为无/轻度组,发生Ⅱ~Ⅴ级不良反应者为中重度组,通过2组患者主要临床特征的比较分析发生中重度不良反应的危险因素,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析IM及NDI谷浓度对中重度不良反应发生风险的预测价值及警戒值。结果纳入分析的患者共119例,113例(95.0%)发生不良反应,无/轻度组65例,中重度组54例。2组患者性别分布和给药剂量分布的差异有统计学意义(χ²=19.772,P<0.001;χ²=9.817,P=0.020),中重度组女性患者占比、给药剂量为300 mg/d者占比和给药剂量为600 mg/d者占比均高于无/轻度组。中重度组患者IM和NDI谷浓度均明显高于无/轻度组,差异均有统计学意义[1695(1258,2261)μg/L比1360(938,1643)μg/L,P<0.001;324(223,379)μg/L比264(217,338)μg/L,P=0.042]。ROC曲线分析结果显示,GIST患者发生中重度不良反应的IM和NDI谷浓度折点分别为1539μg/L(敏感度62.3%,特异度70.3%)和303μg/L(敏感度56.6%,特异度68.7%),以折点浓度将119例患者分组,中重度不良反应发生率IM谷浓度>1539μg/L组和≤1539μg/L组分别为63.0%(34/54)和30.8%(20/65),NDI谷浓度>303μg/L组和≤303μg/L组分别为59.6%(31/52)和34.3%(23/67),差异均有统计学意义(P<0.001;P=0.006)。结论IM和NDI谷浓度对GIST患者中重度不良反应发生风险有一定预测价值。对IM谷浓度>1539μg/L和NDI谷浓度>303μg/L的患者应加强用药监测,以保证用药安全。