鸡真核生物翻译起始因子2α的原核表达与多克隆抗体的制备

为了获得鸡源真核生物翻译起始因子2α(Eukaryotic translation initiation factor alpha two,eIF2α)的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了eIF2α基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-eIF2α。将其转化BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功表达出分子量约51 ku的重组融合蛋白。该融合蛋白表达时的最佳诱导时间、诱导温度和IPTG浓度分别为10 h、45℃和1.5 mmoL/L。通过对该蛋白进行Ni^(2+)柱亲和层析纯化,得到了较高纯度的重组蛋白。将纯化后的eIF2α蛋白免疫新西兰黄兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶8 000,试验结果为后续eIF2α蛋白功能的研究提供了帮助。

猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达

本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达.

采用PCR-RFLP法鉴别IBDV强毒BC6/85株和弱毒B87株

选取传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒力代表株BC6/85和弱毒力代表株B87为研究对象,根据VP2基因保守区设计一对通用引物和两个限制性内切酶位点,分别扩增两个毒株的VP2基因,然后进行BamHⅠ和PstⅠ酶切,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)分析酶切产物,并进行特异性、敏感性和重复性检测.结果表明:所设计的引物均可扩增两个毒株的VP2基因,大小约856 bp;经BamHⅠ和PstⅠ酶切后,BC6/85株的PCR产物被BamHⅠ和PstⅠ切出166、242和449 bp大小的3个片段,而B87株仅被PstⅠ切出242和615 bp大小的2个片段,且重复性好,特异性强.可见,采用PCR-RFLP分析IBDV VP2基因的方法操作简单,是一种能够快速鉴别IBDV强、弱毒株的可靠方法.

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.

新-法二联灭活疫苗免疫不同日龄商品蛋鸡的效果

为探讨新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗(ND-IBD二联灭活苗)对不同日龄商品蛋鸡的免疫效果,选择360只1日龄商品蛋鸡,分别于1、7日龄接种ND-IBD二联灭活苗,对照组接种灭菌生理盐水,分别于21-56日龄,每隔7d采血,分离血清,检测ND和IBD抗体水平,剖检取脾脏与法氏囊观察病变,荧光定量PCR检测免疫因子CD4^+、CD8^+、IL-6、IFN-βmRNA表达量,并进行攻毒保护试验。结果表明,1、7日龄商品蛋鸡接种ND-IBD二联灭活苗,其ND和IBD的抗体水平均有效提高,且在免疫后可以有效保护IBDV强毒的感染,但7日龄免疫效果更好。免疫因子的mRNA表达量检测结果表明,7日龄接种疫苗的免疫组免疫因子CD4^+、CD8^+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量明显高于对照组1日龄。综上,ND-IBD二联灭活疫苗7日龄免疫商品蛋鸡免疫效果更好。

《金色笔记》中“负心汉”心理矛盾与两性和谐的探究

英国作家多丽丝·莱辛创造的小说《金色笔记》以主人公安娜的视角描述了各种不同的两性关系,但所有两性关系中有一个共同点就是女性内心不自由,使男性形象呈现出“负心汉”的倾向。书中的男性精神分裂,主要体现在政治囹圄和感情困境上,从而由人格的分裂导致感情世界的崩塌。但在小说最后,随着自由女性安娜人格的重整,“负心汉”心理得到了安顿,从侧面反映出了两性和谐所需的基本要素。

猪圆环病毒病研究进展

猪圆环病毒病(PCVD)是由圆环病毒科一种体型极小、无包膜、呈环状排列的单链DNA病毒-猪圆环病毒2型(PCV2)引起的一种繁殖障碍和免疫抑制性疾病。文中总结PCVD的病原学特征、流行特点和诊断技术,并结合PCVD疫苗研究进展阐述PCVD的防治。

弗洛伊德人格结构理论下“负心汉”与女性间关系的研究

英国女作家多丽丝·莱辛在创作小说《金色笔记》时,通过表现小说中两性的精神分裂状态,呈现了不同人物的本我、自我和超我状态。据弗洛伊德人格结构理论,任何一种人格突出的时候,就会导致两性的相处处于分裂不和当中,只有达到三“我”合一,人格才是和谐的,两性关系才能和谐。

基于ORF3蛋白的PCV2间接ELISA诊断方法的建立

ORF3蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type,2PCV2)的一个重要的非结构蛋白。根据GenBank数据库中PCV2的ORF3基因序列设计引物,以PCV2基因组为模板进行PCR扩增,并构建重组表达质粒。将重组质粒转染至BL21感受态细胞,进行最佳诱导条件的选择,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组ORF3蛋白作为酶标包被抗原,优化反应条件,建立PCV2间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)诊断方法。结果显示,重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定构建成功。重组蛋白表达的最佳诱导条件为37℃、8 h、1 mmol/LIPTG。Western-blot结果表明,该重组蛋白具有较好的免疫原性。Ni-NTA亲和层析纯化结果表明,280 mmol/L咪唑为最佳洗脱浓度。iELISA的最佳包被抗原质量浓度为0.03 mg/m L,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳工作浓度为1∶4 000。批内和批间试验结果表明,该方法具有较好的重复性。此iELISA与PCR检测方法具有良好的一致性。结果表明,基于ORF3蛋白建立的PCV2间接ELISA诊断方法,可以为临床上rCap蛋白基因工程疫苗免疫猪场进行鉴别诊断。