金花清感颗粒中抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成活性成分的筛选与验证

目的:探讨金花清感颗粒中抑制中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成的有效成分及其作用机制。方法:采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap-MS)鉴定金花清感颗粒入血化学成分,利用分子对接技术将入血成分与参与NETs形成关键靶点蛋白H3、NE、MPO、PAD4和HMGB1进行结合能力和模式预测,并利用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导的dHL60细胞验证候选成分抑制NETs形成活性。结果:共鉴定金花清感颗粒入血成分51个,包括生物碱类9个、木脂素类4个、黄酮类21个、萜类11个、氨基酸类1个、有机酸类3个、苯乙醇苷类2个。分子对接结果显示,芹菜素与H3具有较高的结合活性;芦丁与PAD4和HMGB1均有较高结合活性;而汉黄芩苷和毛蕊花糖苷与HMGB1具有较高结合活性。另外,芦丁和毛蕊花糖苷在50,100μmol·L^(-1)时均可以显著降低PMA诱导的dHL60细胞cf-DNA水平,抑制NETs形成,以芦丁抑制作用更强。结论:通过筛选和体外活性测试,获得了2个靶向NETs形成的抑制剂芦丁和毛蕊花糖苷,为阐释金花清感颗粒的药效物质基础提供了依据。

高效液相色谱法同时测定金花清感颗粒中14种成分含量

目的:建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定金花清感颗粒中新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素共14种成分的含量,为金花清感颗粒的质量控制提供参考。方法:采用Agilent-Eclipse XDB-C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相,进行梯度洗脱,检测波长230 nm,流速1.0 mL·min^(-1),柱温30℃,进样量10μL。结果:建立了同时测定金花清感颗粒中14种成分含量的HPLC检测方法,新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素和千层纸素分别在1.03~20.50,0.72~14.76,1.76~43.93,0.50~10.02,2.50~49.97,2.50~50.02,1.40~27.98,9.66~193.14,1.05~20.90,8.89~177.76,3.39~67.84,0.55~10.92,0.09~10.12,0.20~10.45μg·mL^(-1)范围内线性关系良好(r≥0.9990),平均加样回收率(n=9)分别为95.85%,97.66%,104.92%,96.40%,96.67%,95.57%,95.61%,99.45%,96.54%,97.38%,96.56%,96.71%,102.42%,97.77%,RSD均小于3.0%。10批金花清感颗粒中上述14种成分的含量范围分别为1.19~1.42,0.20~0.37,6.51~7.72,0.20~0.25,2.12~2.80,1.75~2.46,0.89~1.14,14.41~16.58,0.41~0.64,15.85~20.01,2.80~3.44,0.38~0.53,0.02~0.03,0.07~0.11 mg·g^(-1)。结论:建立的HPLC法稳定可靠,重复性好,简便可行,可用于金花清感颗粒质量控制评价。

鼻腔滴注与气管滴注脂多糖建立小鼠急性肺损伤模型的比较研究

目的:通过比较鼻腔滴注与气管滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠模型在不同时间点肺组织损伤情况,为探讨ALI的发病机制及治疗研究提供动物模型。方法:小鼠以LPS 5 mg/kg鼻腔滴注和气管滴注20μL/20 g复制ALI模型,分别在造模后6、12和24 h取材,通过检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞数量、总蛋白浓度、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)含量,以及肺组织湿/干质量(W/D)比、髓过氧化物酶(MPO)活力、HE染色、免疫荧光染色和TLR4蛋白表达来反映中性粒细胞浸润、炎症反应以及肺微血管损伤情况。结果:与正常对照组相比,鼻腔滴注和气管滴注LPS后BALF中白细胞数目和总蛋白浓度逐渐升高(P<0.01),12 h时白细胞数量分别为(3.007±0.121)×10^(5)个/mL、(3.459±0.258)×10^(5)个/mL,总蛋白浓度分别为(0.502±0.037)mg/mL和(0.592±0.006)mg/mL;滴注LPS后6 h BALF中IL-1β和TNF-α含量升高,12 h BALF中IL-6和MIP-2活力升高;12 h和24 h肺组织W/D比值、MPO活力、Ly-6G表达、中性粒细胞浸润及炎症反应显著升高(P<0.01);气管滴注后6 h TLR4蛋白表达显著上调,而鼻腔滴注后12 h TLR4蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论:鼻腔与气管滴注LPS均可制备小鼠ALI模型,与鼻腔滴注法相比,气管滴注法激活TLR4时间较早,肺组织炎症反应较高。

苍夷纳米乳原位凝胶的制备及体外鼻黏膜释药机制研究

制备苍夷纳米乳原位凝胶并研究其体外鼻黏膜释药机制。对复方中不同饮片进行提取后,通过伪三元相图法确定纳米乳处方,分别以混合乳化剂与油相的比例[(S+COS)/O],混合乳化剂的比例(Km),水相与混合乳化剂和油相的比例[W/(S+COS+O)]为考察因素,以归一值(OD)为评价指标,利用星点设计-效应面法优化苍夷纳米乳处方;以泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)的比例为考察因素,以胶凝温度为评价指标,优化苍夷纳米乳原位凝胶处方。采用改良Franz扩散池法,以氧化苦参碱、阿魏酸、丹酚酸B含量为指标,研究苍夷纳米乳原位凝胶鼻黏膜释药机制。优选苍夷纳米乳原位凝胶处方组成蓖麻油聚烃氧酯(35)(EL-35)为6.862%,无水乙醇为4.262%,油酸乙酯为1.392%,P407为7%,P188为6%。其平均pH 5.55,平均胶凝温度32.8℃。体外释放研究表明氧化苦参碱、阿魏酸、丹酚酸B同步释放且释药行为均符合Higuchi模型。苍夷纳米乳原位凝胶制备工艺稳定,pH、胶凝温度、黏度适宜,具有一定缓释作用,可满足鼻腔局部用药需求。

苍夷纳米乳原位凝胶高效液相指纹图谱建立及多成分定量分析研究

目的:建立苍夷纳米乳原位凝胶高效液相(HPLC)指纹图谱,进行化学模式识别分析,同时测定多指标成分含量,以对多批成方制剂进行质量评价。方法:采用Venusil XBP C_(18)(L)(4.6 mm×250 mm, 5μm)色谱柱,乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相梯度洗脱,柱温30℃,流速0.8 mg·mL^(-1),检测波长220 nm,进样量10μL。利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)》进行相似度评价,对照品比对分析主要共有峰,并测其含量。结果:建立10批苍夷纳米乳原位凝胶HPLC指纹图谱,相似度均在0.98以上。采用SPSS 21.0、SIMCA 14.1软件进行主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA)将样品大致分为3类,并结合偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),指认丹参酮ⅡA(34号峰)和丹酚酸B(16号峰)等是导致样品差异的主要标志性成分。同时建立测定样品中苦参碱、氧化苦参碱、绿原酸、阿魏酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的HPLC分析方法,定量分析条件经方法学验证,平均加样回收率在97.8%~100.83%。结论:该方法简便可行,可系统、全面地评价苍夷纳米乳原位凝胶的质量,为进一步药效及制剂研究奠定基础。

复方麝香黄芪滴丸HPLC指纹图谱的建立及多成分含量测定

目的:建立复方麝香黄芪滴丸高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)指纹图谱,并同时测定8种指标性成分含量,由此建立多批成方制剂的质量控制方法。方法:采用Venusil XBP C 18(L)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,柱温为30℃,流速为1.0 mL·min^-1,检测波长为230 nm。通过相似度评价软件对10批制剂进行质量评价,并对指认的8种指标性成分进行含量测定。采用SPSS 25.0对10批制剂相对峰面积进行聚类分析。结果:建立了复方麝香黄芪滴丸的HPLC指纹图谱,标记21个共有峰,指认了8个峰。10批样品的指纹图谱相似度均在0.90以上。聚类分析将10批样品分为2类,S1和S8被聚为第1类,其他被聚为第2类。8种指标性成分在一定浓度范围内线性良好,平均加样回收率良好。10批样品含量测定结果为没食子酸0.0967~0.1049 mg·g^-1,羟基红花黄色素A 0.1828~0.2373 mg·g^-1,芍药苷0.5600~0.6006 mg·g^-1,毛蕊异黄酮苷0.4290~0.4554 mg·g^-1,阿魏酸0.0316~0.0342 mg·g^-1,芒柄花苷0.1714~0.1973 mg·g^-1,毛蕊异黄酮0.0826~0.0935 mg·g^-1,芒柄花素0.1240~0.1414 mg·g^-1。结论:该方法简便可行,指纹图谱分离效果良好,含量测定方法可靠,可为复方麝香黄芪滴丸成分分析和质量控制提供依据。

银花清咽纳米乳喷雾剂HPLC指纹图谱及4种成分含量测定

目的:建立银花清咽纳米乳喷雾剂HPLC指纹图谱同时测定绿原酸、木犀草苷、甘草酸铵和丹皮酚的含量,对多批成方制剂进行质量评价。方法:采用Diamonsi C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱,柱温30℃,检测波长:350 nm,进样量为10μL。运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”评价10批次银花清咽纳米乳喷雾剂HPLC指纹图谱相似度,SPSS 24.0、SMICA 14.1软件进行聚类分析、主成分分析和偏最小二乘法判别分析。结果:10批样品中出现32个共有峰,相似度均大于0.96,样品共聚类为3类,对其来源进行确定,指认了绿原酸、木犀草苷、甘草酸铵、丹皮酚4种成分,这几个成分的线性范围分别为2.8~22.4,0.07~0.56,0.36~2.95,1.12~8.96μg·mL^(-1)。结论:该方法准确简便,专属性强,重复性好,适用于银花清咽纳米乳喷雾剂的综合评价和质量控制。