利用光驱动的生物杂合系统实现CO_(2)转化生产化学品

太阳能作为清洁能源之一,为缓解化石燃料枯竭和温室气体排放等问题提供了一种高效、经济、可持续的解决方案.自然界中的植物和光合微生物通过自身的光合系统收集并转化太阳能,从而生产生物燃料和生物化学品.然而,由于自然光合系统存在光吸收范围相对较窄、光生电子在传输过程中易损耗等问题,限制了太阳能到化学品的转化效率.为了解决上述难题,科研人员模仿自然光合作用中的关键部分,探索构建人工光合系统,相关研究引起了广泛关注.本文通过将碲化镉量子点(CdTe QDs)与大肠杆菌(E.coli)相耦合,构建了一种光驱动无机-生物杂合系统(IBPHS),用于捕获太阳能并驱动CO_(2)转化合成高价值化学品.该系统主要由光催化模块和生物催化模块组成.在光催化模块中,通过生物合成CdTe QDs进行光能捕获,并将其转化为电子.通过敲除E.coli的Cd2+外排蛋白(ZNTA)编码基因,实现了E.coli胞内Cd2+过量积累.通过“时空耦合”方式,并借助共聚焦显微镜、高分辨率透射电镜和X射线能谱分析,确认了CdTe QDs在E.coli胞内的组装合成.利用紫外-可见分光光度计研究了光催化模块对光子的吸收能力.结果表明,光催化模块的吸收峰位于400-420 nm.利用瞬时光电流,评估了光催化模块的光生电子能力.实验发现,该模块可以产生0.07μA光电流,表明完成了光催化模块的构建.在生物催化模块中,将光催化模块产生的电子用于还原NAD+再生NADH.采用NADH生物传感器,分析了E.coli胞内NADH含量,结果表明,在蓝光照射下E.coli胞内NADH含量比黑暗条件下提高了5.1倍.在此基础上,通过表达NADH依赖型乳酸脱氢酶(LDH)将丙酮酸还原为乳酸,在蓝光光照下乳酸积累量达到了0.44 g/L,而黑暗条件下无乳酸积累,从而验证了生物催化模块的有效性.基于光催化模块和生物催化模块,进一步组装构建了IBPSH,用于驱动CO_(2)还原合成甲酸和丙酮酸.在蓝光照射下,IBPHS能够合成0.65 g/L甲酸和0.18 g/L丙酮酸,其CO_(2)利用速率分别达到51.98 mg/gDCW/h和21.92 mg/gDCW/h,超过了光合细菌.综上所述,本文利用光催化模块与生物催化模块相耦合的方式,组装构建了一种新型的人工光合系统,实现了光驱动CO_(2)还原合成高附加值化学品,为理性设计材料-生物杂合系统提供了借鉴,同时也为挖掘绿色生物制造潜力、开发太阳能化学制造平台提供参考.

代谢工程改造微生物合成生物基单体的进展与挑战

单体是合成聚合物所用的小分子基础原料,目前主要来源于化石燃料。利用微生物制备生物基单体具有生产条件温和、环境友好、可持续的优势,是实现高分子材料行业绿色制造的重要途径。借助代谢工程和合成生物学元件,目前已经实现了多种单体的微生物制造,然而与石油基生产工艺相比,这些单体微生物细胞工厂的生产性能普遍较低。围绕代谢工程改造微生物合成生物基单体过程中存在的瓶颈问题,本文基于具体案例分析,从廉价底物的高效利用、提高生物基单体合成效率、强化细胞环境耐受性三个方面,总结了改造微生物合成单体的最新研究进展。同时,讨论了单体微生物细胞工厂目前存在的挑战和未来发展方向。

代谢工程改造微生物固定二氧化碳研究进展

微生物固定CO_(2)是实现CO_(2)资源化利用的有效策略之一,为固碳减排、节能生产与绿色合成提供了借鉴。然而,微生物在固定CO_(2)过程中存在底物利用效率低、能量需求量大、路径难优化等问题。为了解决这些问题,本文总结了6种天然CO_(2)固定途径与5种人工CO_(2)固定途径,并从自养微生物、异养微生物和人工微生物三个方面系统分析了代谢工程改造微生物固定CO_(2)合成化学品的最新进展。在自养微生物固定CO_(2)方面,采用的策略主要包括提高CO_(2)固定途径效率、开发能量捕集系统与调节碳代谢流分布;在异养微生物固定CO_(2)方面,常用的方法主要有强化羧化途径、重构CO_(2)固定途径与优化能量供给;在人工微生物固定CO_(2)方面,主要的研究思路是设计人工CO_(2)固定途径与构建人工CO_(2)固定微生物。最后,从CO_(2)固定的关键酶、途径和微生物三方面展望了进一步提高CO_(2)固定效率的发展方向。

代谢工程改造微生物利用甲酸研究进展

微生物利用甲酸生产高附加值产品,是实现碳资源回收利用与绿色产业发展的重要策略之一。然而,在微生物利用甲酸过程中存在甲酸利用效率偏低、细胞生长速率缓慢、目标代谢物产量不高等问题。为了解决上述问题,本文从甲酸利用的微生物、代谢路径与代谢工程策略三个方面,系统总结分析了代谢工程改造微生物利用甲酸的研究进展。在甲酸利用微生物方面,概述了天然甲酸利用微生物的代谢特点以及模式微生物的代谢工程改造潜能;在甲酸利用代谢路径方面,梳理了天然的甲酸利用路径、重构与优化的甲酸利用路径与人工的甲酸利用路径的关键步骤、能量/还原力消耗与特点;在甲酸利用代谢工程策略方面,阐述了提高甲酸同化效率与改善甲酸利用微生物细胞生长的关键方法。最后,从甲酸利用的微生物、代谢路径与代谢工程策略三个方面,展望了微生物利用甲酸的发展方向,为甲酸生物经济的发展奠定了基础。

代谢工程改造大肠杆菌生产软骨素

目前生物法合成软骨素的研究策略主要侧重于构建合成路径,缺乏对前体物质供应的精细化调控,从而限制了软骨素的合成效率。为了解决上述问题,本研究借助代谢工程策略,在大肠杆菌(Escherichia coli)中重构与优化了软骨素合成路径,获得了合成软骨素的微生物细胞工厂,实现了发酵法生产软骨素。通过在E.coli BL21STAR(DE3)中表达UDP-葡萄糖脱氢酶(KfoF)、UDP-氨基葡萄糖异构酶(KfoA)和软骨素聚合酶(KfoC),构建了完整的软骨素合成路径。通过氨基转移酶(GlmS)和磷酸葡萄糖胺变位酶(GlmM)的基因表达水平优化,提高了软骨素合成前体UDP-GalNAc的供给量;优化KfoF的基因表达水平,改善了软骨素合成前体UDP-GlcA的供给效率。在5 L发酵罐上,最优工程菌株E.coli GZ17的软骨素产量达到了2.95 g/L。上述研究策略为硫酸软骨素菌株的构建与应用奠定了基础,也为代谢工程改造生产其他糖胺聚糖提供了借鉴。

代谢工程改造酿酒酵母生产L-苹果酸

为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)及C4-二羧酸转运蛋白(Afmae),成功构建了L-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达Afpyc时,其丙酮酸浓度降低了42%,但不能积累L-苹果酸;(2)当共表达Afpyc和Afmdh时,菌株W005积累了1.93 g/L的L-苹果酸,与对照菌株W004相比细胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%;(3)当共表达Afpyc、Afmdh和Afmae时,菌株W006的L-苹果酸产量提高了21.2%,达到2.34 g/L;4)通过提高接种量至初始OD_(600)=2,L-苹果酸的产量提高到3.28 g/L。通过在酿酒酵母中过量表达黄曲霉胞质还原路径的关键基因,使得工程菌能够积累L-苹果酸,为目标产物的高效积累提供了一种可借鉴的思路。

微生物代谢路径的优化与调控

代谢路径平衡对化学品、药品和生物燃料的生产具有重要的作用。为了满足工业化生产的需求,维持代谢路径最优平衡是实现代谢流高效化导向目标代谢产物的必要手段。从DNA、RNA、蛋白质和代谢物四个水平,分析归纳了微生物代谢路径的优化与调控策略,并展望了代谢路径平衡进一步精深调控的发展方向。

调控辅因子水平减少酿酒酵母积累副产物乙醇

C4二元羧酸广泛用于食品、医药和化学等行业,市场潜在需求量巨大。酿酒酵母被认为是发酵生产C4二元羧酸的潜在最适微生物,却产生大量的乙醇,导致了碳流的损失。通过敲除硫胺素合成途径中的调控基因THI2,阻断了硫胺素的合成,使得副产物乙醇产量从5.27±0.23 g/L下降到0.53±0.12 g/L,但影响了葡萄糖消耗和菌体的生长。在此基础上,通过外源添加0.04μmol/L的硫胺素二磷酸,促进了葡萄糖的消耗和菌体生长;进一步通过外源添加1 000μg/L的NAD+,使得葡萄糖的消耗量和菌体的生长分别提高了48.6%和47.2%,而乙醇产量仅增加了0.56 g/L。通过调控辅因子水平(硫胺素和NAD+)可以有效减少副产物乙醇的积累,为解决利用酿酒酵母生产C4二元羧酸中副产物乙醇积累这一普遍性问题提供了一个新的策略。

基于2-酮基-D-葡萄糖酸高产的发酵条件优化研究

为了实现异维生素C前体2-酮基-D-葡萄糖酸在沙雷氏菌Serratia sp. FMME043中的高效生产,在30 L发酵罐中对补料策略和发酵条件进行了优化,建立了补料分批发酵工艺。最终确定发酵策略为:溶氧控制在40%,在发酵16、22 h及28 h时分别补加64、80 g和96 g硫酸铵,并且当残糖浓度降至15～25 g/L时,分五次等量补加801 g葡萄糖,优化后,发酵44 h,2-KGA的产量和转化率分别达到268.5 g/L和1.04 g/g,分别比优化前提高了58.4%和9.9%。本研究结果为目前报道的产量和转化率在国内外属领先水平,为2-酮基-D-葡萄糖酸及异维生素C工业化生产打下了坚实的基础。

谷氨酸氧化酶高产菌株的筛选鉴定及催化生产α-酮戊二酸

采用简易的偶联终点显色反应(Trinder显色反应),从土壤中分离出高产谷氨酸氧化酶(LGOX)的菌株不透明红球菌Rhodococcus opacus FMME1-41,并对此菌株的产酶特性进行研究。结果表明:该菌株所产LGOX主要分泌在发酵液中,对L-谷氨酸具有较强的底物专一性,最适pH 6.5,最适温度为35℃,Mn^(2+)是该酶的激活剂。通过发酵培养基优化,培养30 h时LGOX活力达到6.4 U/m L。利用该酶转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸,在最佳转化条件下转化20 h,α-酮戊二酸产量达到91.2 g/L,转化率为91.8%,α-KG生产强度为4.56 g/(L·h)。

代谢工程改造大肠杆菌利用脂肪酸合成己二酸

己二酸作为生产尼龙、化纤和工程塑料等聚合物的单体,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,己二酸的生物合成主要利用可食用原料,碳原子损失较多,造成己二酸产率较低。为解决上述问题,设计和重构以脂肪酸为原料的己二酸合成新路径,提高己二酸的理论得率;其次,强化本源的β-氧化路径和引入异源的ω-氧化路径;增强细胞对脂肪酸的利用能力;再次,借助系统代谢工程策略,进一步优化己二酸合成路径。最后,经发酵条件优化,最优工程菌Escherichia coli AA0304能够产生1.32 g/L己二酸。上述研究结果为利用废弃脂肪酸类化合物生产高价值化学品奠定了良好的基础。

水稻DH群体苗期耐低氮能力QTL定位分析

利用云南元江普通野生稻与优良籼稻品种"特青"构建的DH群体的139个家系,采用单标记分析法对DH群体中与耐低氮能力相关的QTL进行分析。以株高、鲜重和干重的平均抑制率作为指标,检测到7个与耐低氮相关的QTL,分别位于第4、5、7、10染色体上,在"特青"中定位到1个耐低氮QTL,在野生稻中定位到6个耐低氮QTL。其中,位于第4染色体RM307、RM335和RM303,第5染色体RM440,以及第7染色体RM481和RM172附近的QTL位点,来源于野生稻的等位基因表现为耐低氮胁迫;位于第10染色体RM222附近的QTL位点,来源于栽培稻"特青"的等位基因表现为耐低氮胁迫。检测到的QTL的贡献率均较小,没有定位到主效QTL。

代谢工程改造大肠杆菌生产琥珀酸

琥珀酸(succinic acid)是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用。目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题。为此,本研究通过复合诱变(ARTP和^(60)Co-γ射线)筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸。为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因(pflB-focA)、磷酸转乙酰基基因(pta)、丙酸激酶基因(tdcD)和a-酮丁酸甲酸酯裂解酶基因(tdcE),阻断冗余代谢支路减少副产物积累,获得工程菌株FMME-N-13,琥珀酸得率增加到0.92g/g葡萄糖,同时副产物大大降低,积累0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸。同时,通过调控RBS强度组合优化来自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(AsPCK)和来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因(CbFDH)的表达水平,调控胞内ATP和NADH的浓度,最优工程菌FMME-N-26(FMME-N-13-L-AsPCK-L-CbFDH)的琥珀酸得率增加至1.04g/g葡萄糖,仅积累5.5g/L乙酸;最终,对厌氧阶段葡萄糖浓度进行优化,当葡萄糖浓度控制在0~5g/L时,菌株FMME-N-26的琥珀酸浓度增加到111.9g/L,得率为1.11g/g葡萄糖(理论产率的99%),生产强度为1.76g/L/h,为琥珀酸的工业化生产奠定了良好的基础。

发酵法生产糖胺聚糖的研究进展

糖胺聚糖是一种具有多种生理功能的直链酸性黏多糖,广泛应用于化妆品、保健品和药品等行业。为了满足环境友好、生产安全和可持续发展的社会要求,利用微生物发酵法生产糖胺聚糖越来越受到人们的关注。本文中,笔者在总结糖胺聚糖生物合成路径的基础上,分析归纳了发酵法生产糖胺聚糖的生化工程和代谢工程策略,并展望了糖胺聚糖进一步高效生产的发展方向。

微生物细胞工厂碳流调控进展

随着代谢工程技术的进步,越来越多微生物细胞工厂可用于化学品发酵生产。微生物细胞生产化学品具有生产条件温和、环境友好等优势,是实现化学品绿色可持续生产的重要手段。为了提高微生物细胞工厂的产量、得率和生产强度,传统代谢工程手段主要采用基因过表达或基因敲除方式增大目标代谢路径碳代谢流。然而由于代谢流调控精度不足,易导致细胞生产能力下降。本文主要针对微生物细胞工厂碳流调控中存在的瓶颈问题,从代谢流改造靶点选择、细胞生长与产物合成碳流平衡、副产物路径与产物合成竞争、产物合成效率强化四个角度,系统综述微生物细胞工厂碳代谢流调控的最新进展。并从高精度、仿生学、智能化、多任务、快响应调控工具的设计出发,对未来微生物细胞工厂的发展趋势进行展望。

米曲霉形态对L-苹果酸生产的影响

L-苹果酸是一种重要的C4化合物,广泛应用于食品、化工和医药行业。本文中以米曲霉为出发菌株,研究氮源种类、CaCO3质量浓度、搅拌转速和通气量等关键营养条件和环境条件对Aspergillus oryzae形态和产L-苹果酸的影响。最优发酵条件为:胰蛋白胨为氮源、CaCO3质量浓度为80 g/L、搅拌转速为600 r/min、通气量为2 vvm。进一步分析菌体形态与L-苹果酸产量的关系,得出当单位体积发酵液菌球总体积(V值)为76.4 mm^3/mL时,L-苹果酸产量最高达109.9 g/L。

大肠杆菌生产饲用氨基酸的研究进展

随着畜牧业的快速发展,人们对畜牧饲料蛋白的需求日益剧增。由于人们对食品安全意识的增强,迫切需要开发安全、高效、可持续动物饲料蛋白的供应途径。由于氨基酸是组成蛋白质的基本单元,所以在饲料中添加氨基酸可以替代饲料中的蛋白质,为动物细胞生长发育提供足够的营养。因此,饲用氨基酸作为动物饲料食品添加剂被广泛应用,具有广阔的市场应用前景。利用合成生物学技术,工程化改造大肠杆菌,构建的细胞工厂,以生物质为原料可绿色高效合成饲用氨基酸,而且其具有原料可再生、成本低廉、反应条件温和、环境污染小等优点,为解决动植物提取和化学炼制引起的环境污染问题提供了一种有效解决方案。本文针对饲用氨基酸(赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸和精氨酸)的生物合成途径,介绍了大肠杆菌合成饲用氨基酸的生产瓶颈,并从饲用氨基酸大肠杆菌细胞工厂的构建与优化,综述了利用合成生物学技术改造大肠杆菌细胞工厂合成饲用氨基酸的研究现状。提升饲用氨基酸的生产技术水平、提高大肠杆菌细胞的鲁棒性和增强大肠杆菌细胞对不利环境的耐受能力,可以提升饲用氨基酸发酵性能,简化发酵过程控制,降低饲用氨基酸的生产成本,是未来饲用氨基酸生产菌株工程化改造的方向。

强化前体(UDP-GalNAc)合成路径提高果糖软骨素的生产

硫酸软骨素是一种重要的糖胺聚糖,广泛应用于医药、食品、保健品行业。为了提高硫酸软骨素类似物果糖软骨素的生产,通过过量表达磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)、葡萄糖胺合酶(GlmS),优化融合蛋白glmM-glmS的表达水平,获得了最优工程菌株E.coli K4-H-glmM-glmS,并确定了最适IPTG浓度(0.4 mmol/L)以及诱导温度(37℃)。最后,在5-L罐水平下,借助DO-stat补料模式,果糖软骨素的产量达到了3.99 g/L,较原始菌株提高了108.9%,为工业化生产果糖软骨素奠定了基础。

多酶级联催化合成(R)-β-酪氨酸

目前报道的β-酪氨酸生产方法需要较为复杂的底物而且大多依赖于贵金属催化剂。为了实现生物法绿色合成β-酪氨酸,通过人工设计的级联反应,将酪氨酸酚裂解酶和酪氨酸氨基变位酶进行级联,以苯酚、丙酮酸和铵盐等廉价化合物为底物合成(R)-β-酪氨酸。通过基因挖掘筛选了所需的酶元件,并采用蛋白质工程改造,提升了限速酶的催化效率。在大肠杆菌宿主中对所筛选的酶进行共同表达,经优化获得了(R)-β-酪氨酸合成菌株E.coli S10。在1 L规模反应中,菌株E.coli S10合成(R)-β-酪氨酸的转化率达到78%,ee值>99%。利用高分辨质谱(HRMS)和核磁共振图谱(NMR)分别鉴定了纯化产物的分子量和结构,结果表明通过该级联路径可成功合成目标产物(R)-β-酪氨酸。研究工作可为(R)-β-酪氨酸的绿色酶法生产提供理论指导。

ZIF-8-戊二醛固定化细胞生产α-酮戊二酸

为了提高表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)重组大肠杆菌的催化稳定性,本研究采用了沸石咪唑框架(ZIF-8)涂层和戊二醛(GA)交联的组合固定技术。确定了ZIF-8和GA的工艺参数以及固定化细胞的催化性能,并对固定化重组大肠杆菌催化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸(α-KG)的稳定性展开了研究。当2-甲基咪唑、醋酸锌和戊二醛的添加量分别为240mmol/L、80mmol/L和50mmol/L时,固定化细胞(E.coli@ZIF-8-GA)的比活性和活性回收率分别达到33.4U/g和95.83%。结果表明,在重复使用10个批次后,E.coli@ZIF-8-GA转化生产α-酮戊二酸的产量仍能达到70.03g/L。与游离细胞相比,固定化细胞对温度和pH的耐受性均发生显著提高。