FOXN1基因敲除兔嵌合体的建立

目的建立F0代FOXN1基因敲除兔嵌合体,以探究普通饲养环境免疫缺陷兔活体保种的方法。方法首先,利用CRISPR/Cas9技术,将构建好的sgRNA和Cas9蛋白注入兔二细胞期胚胎的一个细胞中,以获得FOXN1基因编辑嵌合体胚胎。然后,胚胎移植至代孕母兔。最后,通过PCR技术以及Sanger测序方法鉴定F0代仔兔基因型,并观察其在普通饲养环境生长发育的情况。结果PCR结合Sanger测序结果表明FOXN1基因敲除兔嵌合体构建成功。经观察,嵌合体在普通环境下生长发育良好,无免疫缺陷表型。结论本研究初步建立了在普通环境下可正常生长发育的FOXN1基因敲除兔嵌合体,为后续进一步繁育FOXN1免疫缺陷兔奠定了研究基础。

应用16S rRNA高通量测序法比较人与常用实验动物口腔菌群的异同

目的应用16S rRNA高通量测序法测定几种常用实验动物(西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰兔、Wistar大鼠)的口腔菌群,并和人的口腔菌群进行对比分析,为口腔微生态的动物模型研究提供基础性资料。方法用一次性棉拭子采集西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰兔、Wistar大鼠和人的口腔菌群标本,提取样品总DNA,使用带标签的通用引物扩增16S rRNA V4区片段,Illumina测序,经BIPES以及QIIME分析比较菌群多样性及结构。结果人与5种常用实验动物口腔菌群的丰富度均差异显著(P<0.05),不同种类动物有其各自独特的口腔菌群,但猴的口腔菌群与人最为相似。结论根据与人口腔某类菌群的相似程度,5种动物中,猴口腔的梭菌属(Fusobacterium)、卟啉菌属(Porphyromonas)水平与人最相似,提示猴可能是研究人口腔菌群较适宜的模型动物。从特定菌门角度,西藏小型猪可能是研究与变形菌门(Proteobacteria)相关疾病的较适宜模型动物;比格犬可能是研究与螺旋体门(Spirochaetes)相关疾病的较适宜模型动物。

构建Alb启动子调控HBEGF肝特异性表达的慢病毒载体及其功能验证

目的构建肝特异性Alb(白蛋白)启动子调控HBEGF(Heparinbinding-epidermal growth factor)表达的慢病毒载体p LV-ATTG。方法首先以p Alb-Cre-GH/BS为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Not I酶切的p TRECK6-GFP中,获得p AlbTRECK6(TRECK:toxin receptor-mediated conditional cell knockout);接着以p Alb-TRECK6为模板,PCR扩增Alb-TRECK6,In-Fusion克隆至Xba I/Bam H I酶切的p CD823A-1载体(该载体已卸去EF-1α启动子)中,获得最终的慢病毒载体p LV-ATTG,所构建的质粒均经测序和酶切鉴定。然后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装。包装成功的慢病毒LV-ATTG感染肝癌细胞株BEL-7402细胞,倒置荧光显微镜检测cop GFP表达,并收集细胞提取总RNA,以检测HBEGF表达。结果酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体p LV-ATTG;LV-ATTG感染BEL-7402细胞后,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,同时q RT-PCR检测结果显示HBEGF转基因能够正常表达。结论成功构建Alb启动子调控HBEGF表达的慢病毒表达载体,为相关后续研究奠定了坚实基础。

Hpd基因修饰制备高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除巴马小型猪4-羟基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase,4HPPD/HPD)制备高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型。方法分别从质粒pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9中通过PCR扩增sgRNA-Hpd和Cas9体外转录用模板,接着体外转录出Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd,最后将Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd共注射入巴马小型猪受精卵的胞质内,以制备Hpd基因敲除巴马小型猪。结果胞质内共注射后,共移植20枚受精卵至2只代孕母猪。获得子代Hpd基因敲除巴马小型猪共4只。结论本研究成功制备了高酪氨酸血症Ⅲ型巴马小型猪模型,将为研究酪氨酸代谢通路提供更好的模型。

Ⅰ型遗传性酪氨酸血症动物模型研究进展

I型遗传性酪氨酸血症(hereditary tyrosinemia type 1,HT1)是一种常染色体隐形遗传病,主要是由于FAH基因(fumarylacetoacetate hydroxylase,FAH)突变导致酪氨酸代谢发生障碍,不能正常代谢延胡索酸和乙酰乙酸。临床上主要表现为严重的肝、肾损伤,甚至肝癌。依赖基因编辑技术的发展,Fah基因修饰的小鼠、大鼠、兔和小型猪模型均相继成功制备。目前,这些动物模型已经广泛应用于人类HT1疾病的病理生理、肝脏生物学、肝干细胞以及肝癌基因治疗的研究,同时也用于制备人源化肝和人肝细胞扩增的生物反应器。本文拟对I型遗传性酪氨酸血症动物模型的相关研究进展进行综述和探讨,为更好的研究该疾病提供一些线索。

利用CRISPR/Cas9系统构建HMGA2敲除肝癌细胞株及其功能鉴定

目的采用CRISPR/Cas9系统敲除肝癌细胞系HepG2的高迁移率蛋白A2(HMGA2)基因,探讨HMGA2敲除对于肝癌细胞生长、增殖、迁移以及侵袭的影响。方法根据GenBank数据库搜索人HMGA2序列,利用在线sgRNA设计软件针对HMGA2的第一外显子以及第二外显子各设计一条sgRNA,构建靶向HMGA2的sgRNA重组敲除载体sgE1和sgE2,将sgRNA载体转染细胞,通过有限稀释法筛选得到HMGA2^-/-细胞株。通过CCK8实验以及平板克隆形成实验检测HMGA2敲除对于HepG2细胞生长以及克隆形成能力的影响;采用Transwell实验检测HMGA2敲除对于HepG2细胞迁移与侵袭的影响。结果相比于野生型,HMGA2^-/-细胞株的生长速率减慢,克隆形成能力(121.83±21.68 vs 59.50±20.68,P<0.01)、迁移(359.67±32.53 vs 245.61±24.23,P<0.05)与侵袭(251.33±43.43 vs 47.00±10.00,P<0.01)能力显著下降。结论HMGA2敲除降低了肝癌细胞HepG2的体外生存能力以及转移能力,HMGA2基因可以作为一个肝癌治疗的潜在靶点。

广州地区藏鸡血液生理和生化指标测定分析

目的测定广州地区藏鸡血液生理和生化指标特性,并进行分析。方法采集广州地区藏鸡的血液样品,应用全自动五分类血球仪和血液生化分析仪分别检测其血液生理和生化指标。结果 (1)RBC、PLT、PDW、RDW-SD和P-LCR的测定值雌雄之间差异无显著性(P>0.05);(2)HCT(P<0.05)、MCHC(P<0.05)、MPV(P<0.05)、HGB(P<0.01)、MCV(P<0.01)、MCH(P<0.01)的测定值雄性显著高于雌性;(3)RDW-CV的测定值雄性显著低于雌性(P<0.01);(4)AST、TRIG、ALKP、ALT、Ca、CHOL、CREA、GLU、PHOS和TBIL的测定值雌雄之间差异无显著性(P>0.05);(5)AMYL(P<0.05)、TP(P<0.01)的测定值雄性显著高于雌性;(6)ALB(P<0.01)、UREA(P<0.05)、GLOB(P<0.01)的测定值雄性显著低于雌性。结论获得了广州地区藏鸡血液生理和生化指标的基础数据。

广州地区藏鸡与五黑鸡血液生理和生化指标的比较分析

为建立广州地区藏鸡与五黑鸡血液生理和生化指标正常参考值,并进行比较分析,采集藏鸡与五黑鸡的血液样品,用全自动五分类血球仪和爱德士血液生化分析仪分别检测其血液生理和生化指标。藏鸡的血小板(PLT)、血小板平均容积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、大血小板比率(P-LCR)极显著或显著高于五黑鸡(P <0.01或P <0.05),而藏鸡的红细胞分布宽度(RDW-SD)极显著低于五黑鸡(P<0.01);藏鸡的碱性磷酸酶(ALT)谷丙转氨酶(AMYL)均显著低于五黑鸡(P<0.05),而藏鸡的GLU极显著高于五黑鸡(P<0.01);两个品种间其他生理和生化指标差异不显著(P>0.05)。研究获得了广州地区藏鸡和五黑鸡血液生理和生化指标,同时藏鸡在广州地区经过人工驯化饲养后较好地适应了亚热带气候,其大部分血液生理和生化指标与五黑鸡的比较接近。

广州驯化藏鸡与五黑鸡蛋品质及营养成分比较分析

目的本实验旨在研究广州地区驯化藏鸡的蛋品质及营养成分,并与五黑鸡鸡蛋的相关指标进行比较分析。方法实验依据禽类蛋品质及营养成分相关测定方法,分别测定广州驯化藏鸡和五黑鸡蛋品质及营养成分指标。结果 (1)广州驯化藏鸡蛋的各项品质指标与五黑鸡鸡蛋之间差异无显著性(P> 0.05);(2)广州驯化藏鸡蛋的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和碳水化合物的测定值与五黑鸡蛋之间差异无显著性(P> 0.05);(3)广州驯化藏鸡蛋的硒、铁和锌的测定值显著高于五黑鸡蛋的相应指标(P<0.05);(4)广州驯化藏鸡蛋中吡啶(P<0.01)、吡啶硼烷(P<0.05)和十二烷(P<0.05)的测定值显著低于五黑鸡鸡蛋的相应指标,而1-十六烯、14-甲基十五烷酸甲酯、亚油酸甲酯、油酸甲酯和硬脂酸甲酯的测定值则显著高于五黑鸡蛋(P<0.05)。结论广州驯化藏鸡蛋中的粗蛋白、粗脂肪、硒、铁和锌,以及多种油酸甲酯含量均高于五黑鸡蛋。

五黑鸡血液生理和生化指标的测定

目的测定五黑鸡正常血液生理和生化指标的基础数据。方法采集五黑鸡的血液样品,应用全自动五分类血球仪和血液生化分析仪分别检测其血液生理和生化指标,并进行统计分析。结果 (1)公鸡的红细胞总数、血红蛋白、红细胞比积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度显著高于母鸡(P<0.01或P<0.05);(2)公鸡的红细胞分布宽度变异系数、红细胞分布宽度标准差显著低于母鸡(P<0.01或P<0.05);(3)公鸡的钙显著高于母鸡(P<0.01);(4)公鸡的甘油三酯白蛋白、总胆固醇、总胆红素、总蛋白、球蛋白显著低于母鸡(P<0.01或P<0.05);(5)其它生理和生化指标公母之间差异不显著。结论获得了广东地区五黑鸡12项血液生理和15项生化指标的正常参考值,为其应用研究提供基础数据。

短串联重复序列扫描技术对无特定病原体新西兰兔遗传结构的分析

应用STR扫描技术,对广东省医学实验动物中心SPF级新西兰兔进行遗传检测和分析,以掌握该兔群体遗传结构,为制定繁殖育种方案提供依据,并为兔遗传分析方法提供参考。试验采集33只种兔耳静脉血,提取基因组DNA,选用多态丰富的23个微卫星位点对基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物进行STR扫描,扫描结果运用popgene32软件分析群体观察等位基因数、有效等位基因数、香隆指数和有效杂合度等遗传结构信息。结果显示,全部23个微卫星位点PCR扩增良好,兔群体平均观测等位基因数为1.5217,平均有效等位基因数为1.2786,平均香隆指数为0.2442,平均有效杂合度为0.1564。初步掌握了该SPF级新西兰兔群体遗传结构。结果表明,STR扫描技术及选用的23个微卫星位点适用于兔群体遗传结构检测和分析,将为兔遗传分析方法提供参考和依据。