高产光学纯（R）-乙偶姻工程菌株的构建与发酵工艺优化

本研究拟在大肠杆菌中构建光学纯(R)-乙偶姻的合成途径和利用辅酶工程调控NADH/NAD+氧化还原平衡,并对工程菌发酵(R)-乙偶姻进行优化。将来源于Enterobacter cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA和来源于Lactobacillus brevis的NADH氧化酶基因noxE进行密码子优化后组成基因簇,构建表达质粒并导入大肠杆菌,进一步优化工程菌的培养基成分和发酵条件,提高(R)-乙偶姻的合成能力。结果表明:获得专一性合成高光学纯(R)-乙偶姻的大肠杆菌工程菌株GXASR,对其发酵条件进行系统优化后,摇瓶发酵的(R)-乙偶姻产量为36.82g/L,光学纯度达99.1%,发酵罐补料发酵的(R)-乙偶姻产量达到67.65g/L。在大肠杆菌细胞中过表达外源基因簇budB-budA-noxE能够高效合成光学纯(R)-乙偶姻,经发酵优化后,工程菌的(R)-乙偶姻产量、生产强度和得率均显著提高,为代谢工程改造大肠杆菌生产高光学纯(R)-乙偶姻提供了理论基础。

酵母菌合成2-苯乙醇的研究进展

2-苯乙醇是一种具有令人愉悦的玫瑰风味的芳香醇,在食品、化妆品和药品等领域具有广泛的应用。本文对酵母菌合成2-苯乙醇的代谢途径及其调控过程、以及提高2-苯乙醇产量的国内外研究进展进行了综述,并对通过微生物转化法合成2-苯乙醇目前存在的不足及进一步研究方向进行了讨论。

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。

重组枯草芽孢杆菌发酵廉价原料生产普鲁兰酶

[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌B.subtilis WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn^(2+)、Fe^(3+)、Fe^(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。

高产光学纯(R,R)-2,3-丁二醇工程菌株构建与发酵优化

[目的]构建能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇的大肠杆菌工程菌,并进行发酵条件优化。[方法]将来源于多粘芽孢杆菌的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh,来源于阴沟肠杆菌的α-乙酰乳酸合成酶基因bud B和α-乙酰乳酸脱羧酶基因bud A与表达载体p Tr C99A连接,导入大肠杆菌中构建人工合成途径。筛选最适的培养基和发酵条件,提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量、产率和得率。[结果]获得高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的工程菌株GXASB,筛选到最适碳源及其浓度为120 g/L木薯淀粉,最适pH为6.5,最适接种量为10%,在发酵罐中进行同步糖化法发酵,(R,R)-2,3-丁二醇产量达到105.28 g/L,光学纯为99.1%,得率为0.47 g/g,生产强度为1.95 g/(L·h)。[结论]在大肠杆菌中表达基因簇bud B-bud A-bdh能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇,经优化发酵条件后,能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的合成效率。同时工程菌能够利用非粮原料木薯淀粉高效生产(R,R)-2,3-丁二醇,补料发酵产量达到105.28 g/L,为使用廉价原料工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考。

代谢工程改造多粘芽孢杆菌及合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇

(R,R)-2,3-BD是一种重要的四碳平台化合物,在液晶材料、高附加值手性化合物,尤其是不对称合成光学纯药物等方面有天然优势。将来源于多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) DSM 365的α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase)基因alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase)基因alsD和(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanediol dehydrogenase)基因R,R-bdh与表达载体pMA5连接,导入多粘芽孢杆菌P. polymyxa DSM 365中加强(R,R)-2,3-丁二醇的主代谢途径,构建可高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的多粘芽孢杆菌工程菌株DM-5。利用工程菌株DM-5补料分批发酵60 h,(R,R)-2,3-丁二醇产量达54.91 g/L,得率为0.52 g/g,生产强度为0.92 g·L^(-1)·h^(-1),与野生菌株相比(R,R)-2,3-丁二醇产量增加19.66%,且副产物甲醇浓度不变,乙醇、乙偶姻积累下降。本研究结果表明,在多粘芽孢杆菌中过量表达关键基因alsS、alsD和R,R-bdh能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量和生产强度,为多粘芽孢杆菌的代谢工程改造和工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考。