核桃SPL基因家族的系统进化和表达分析

【目的】SQUAMOSA promoter binding protein-like(SPL)转录因子在植物开花诱导中起重要的调控作用。从核桃基因组中鉴定SPL(JrSPL)基因家族成员并分析其表达特性,为探究SPL在核桃开花诱导中的功能研究提供参考。【方法】采用生物信息学方法鉴定JrSPL基因家族成员,并预测其基本理化性质、保守结构域、进化关系、启动子顺式作用元件等;利用转录组测序和RT-qPCR技术分析JrSPL家族成员在核桃不同组织及嫁接诱导开花后的表达水平。【结果】JrSPL家族有28个成员,其基因结构和蛋白结构均高度保守,分布在核桃14条不同的染色体,与拟南芥和毛果杨分别存在17处和24处共线性关系,根据系统发育关系可分为8组。JrSPL启动子存在大量的光响应元件、激素应答元件、胁迫响应元件等。转录组测序分析显示,JrSPL基因在核桃不同组织表达量有差异,在雄花、雌花、顶芽及叶中均有表达,多数基因在雌花中的表达量都比较高,有6个基因最为显著,它们可能在开花诱导中起关键作用。在嫁接诱导核桃开花材料中,检测的12个JrSPLs中除了JrSPL8外,在开花材料中的表达量均高于对照,JrSPL2和JrSPL25在混合花序的雄花中表达显著,JrSPL8在顶芽中高表达。【结论】JrSPL基因在核桃成花中具有重要作用,其高表达是花期提前的主要因素。

核桃BES-SSR的开发及在遗传多样性分析中的应用

从NCBI数据库全部已知核桃Mbo I基因组BAC文库克隆中下载22 740条末端序列（BAC end sequences,BES）。应用MISA软件搜索获得SSR位点4 732个,平均每2.8 kb出现1个SSR。在含有单个SSR的BES中,1-3个核苷酸重复的类型占SSR总数的96.86%,A/T、AT/AT、ATT/AAT分别为最丰富的单核苷酸、2核苷酸和3核苷酸重复。选择不同类型和重复次数的SSR设计合成50对引物,从中筛选出多态性引物33对,其中19对引物扩增出1或2个等位基因,无非特异扩增产物。应用这19对引物对20份核桃属不同种的基因型进行SSR分析,结果表明,每对引物检测到2-9个多态性位点,平均多态性位点5.4个;其中17个位点的多态信息含量高于0.5,总平均值为0.662,多态性较高。聚类分析显示,不同基因型按照种属分类及地理起源分组。因此,BES-SSR是一类多态性高,可用于核桃属植物遗传分析的新SSR引物。

利用微束激光穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究初报

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pB IBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株。研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等。研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难。

基因枪介导外源基因转化棉花幼胚方法的研究

以棉花幼胚作为外源基因转化的受体,用基因枪法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pBIBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。基因枪转化处理的幼胚经卡那霉素(Kan)筛选培养,已获得了抗性植株。研究表明用基因枪法转化处理棉花幼胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入幼胚,因而避开了植株离体再生的困难。

巨龙竹木质素合成关键基因CCoAOMT的克隆及表达分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT,caffeoyl-CoA O-methyltransferase)是木质素合成过程中关键酶之一。研究通过逆转录PCR(RT-PCR)从巨龙竹(Dendrocalamus sinicus L.C.Chia&J.L.Sun)发育早期的竹笋中克隆了CCoAOMT基因(DsCCoAOMT),基因全长cDNA序列为777 bp,编码258个氨基酸,理论分子量28.85 kD,等电点为5.35,蛋白质结构预测的结果显示该蛋白含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。系统进化分析表明,巨龙竹CCoAOMT基因与禾本科植物CCoAOMT基因同源性最高,亲缘关系最近;与非禾本科单子叶植物的亲缘关系次之,然后是裸子植物,与双子叶植物的亲缘关系最远,说明CCoAOMT基因在双子叶植物和单子叶植物之间的差异可能在被子植物进化之前就已经存在。DsCCoAOMT基因密码子偏好性分析的结果显示,该基因选择偏性较强且偏好以G/C结尾;密码子使用频率比较结果发现,DsCCoAOMT基因在微生物中异源表达分析时采用酵母表达系统更为合适,而模式植物拟南芥、烟草、番茄与巨龙竹CCoAOMT密码子使用频率差异较小,尤其烟草、番茄可能是该基因进行转基因功能验证时最为理想的受体。实时荧光定量PCR分析巨龙竹不同组织及竹笋发育过程中DsCCoAOMT基因表达水平的结果显示,该基因在巨龙竹不同组织中的表达具有明显差异,竹笋中表达量最高,茎秆中次之,叶片中最少;随着竹笋的发育,DsCCoAOMT基因的表达量上调并在竹笋发育中期维持较高水平,表明DsCCoAOMT基因可能在巨龙竹快速生长中发挥重要调节作用。本研究的结果为进一步阐明DsCCoAOMT基因的功能和作用机制奠定了基础。

大巴山区核桃实生居群的坚果表型和遗传多样性

【目的】大巴山区因其地理和气候原因是我国生物多样性也是核桃资源分布最为重要的地区之一。近年来,由于经济利益驱使,种质资源破坏十分严重。本研究针对该区域核桃实生居群现状开展研究,以期探明其种质多样性特点及居群遗传结构,为科学有效利用和保护提供依据。【方法】选取该区域12个实生居群386个实生单株为试材,单株为1个样本,分别对每个样本坚果(每样本选30个均匀坚果)12个表型性状变异和坚果播种苗(每个样本选1株播种苗)16个等位基因位点遗传多样性进行分析。【结果】1)大巴山区核桃实生居群坚果表型性状变异系数介于26.75%～34.36%之间,平均为30.60%,小果型(单果质量小于6 g)资源占有一定比例;居群遗传性状Shannon指数介于1.112～1.546,平均为1.324;平均期望杂合度介于0.612～0.718,平均为0.688。说明该区域核桃坚果表型和遗传多样性均比较丰富。2)居群间的坚果表型分化和遗传分化系数分别为0.081 5和0.063 2,说明居群内变异是该区域核桃坚果表型和遗传变异的主要来源。3)聚类分析结果表明该区域核桃坚果表型性状Manhattan距离和遗传相似系数均表现出与地理距离显著正相关的趋势。【结论】大巴山区核桃在长期的实生繁殖和多样的立地环境中形成了丰富的坚果表型和遗传变异,是我国重要的核桃资源多样性分布区域。研究结果对该区域的实生选种和资源保护策略的制定具有重要的参考意义。

种子贮藏蛋白电泳技术在棉花品种鉴定中的应用

实验采用了50个经过长期大面积种植的棉花种质材料,利用改良的种子贮藏蛋白电泳技术进行棉花品种的鉴定研究。改良后的种子蛋白提取方案,克服了棉花种子中含油脂较多影响电泳结果的问题;采用连续体系的阴极电泳,使电泳周期缩短为2.5h,简化了操作步骤,重复性好,谱带清晰,有较高的多样性。

马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及其抗晚疫病的初步鉴定

为获得抗晚疫病的转基因马铃薯植株,采用根癌农杆菌介导法,以微型薯薯片为外植体,将萝卜抗菌肽基因(AFP)导入马铃薯栽培品种夏波蒂(Shepody)中,通过草甘膦抗性筛选和PCR检测获得了4株转基因试管苗,并经黑暗诱导获得了微型薯。采用离体叶片接种法,对微型薯长出的叶片进行抗晚疫病鉴定,结果表明这4个株系的抗病性均有一定程度的提高。

适合MSAP分析的核桃子叶DNA提取方法

核桃（Juglans regiaL．）营养价值高，含有丰富的脂肪酸和蛋白质[1]，子叶是核桃重要的营养储存器官，作为常用的实验材料，可用来组织培养进行生根实验等相关研究[2-3]。MSAP是在AFLP基础上建立起来的在全基因组范围检测5’-CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化的实验技术[4]，具有多态性高、无需预知DNA序列的优点，但其需要提取高质量的基因组DNA，存在于DNA中的多糖等杂质会对酶切等后续实验造成较大影响[5]。

激光微束在植物外源基因转化上的应用

本文概述了近年来激光微束在植物外源基因转化上的最新进展,激光微束转化法的关键技术及应用。并对其今后的应用前景作了展望。

‘辽宁2号’核桃品种矮化机制初探

核桃是我国重要的经济树种,在发展山区经济、退耕还林和保障粮油安全等方面扮演重要的角色。在植物学和树木分类学中核桃属植物通常被定义为高达乔木,自然生长情况下,成年树树高可达25~30 m[1-2]。

核桃MSAP试验体系建立及引物筛选

以‘中宁强’核桃品种成熟叶片为材料,通过优化可影响甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)分析的因素,建立适用于核桃MSAP分析的试验体系,并用于MSAP试验引物筛选。结果表明:采用该优化的MSAP试验体系获得了清晰、重复性好的银染图谱,从90对MSAP引物中,筛选出43对条带清晰且稳定多态的引物,表明该体系可用于核桃DNA甲基化模式分析。

激光微束在遗传操作上的应用

本文概述了近年来激光微束在染色体微切割和微分离、分子细胞生物学、去除细胞壁、诱导原生质体融合等方面的应用 。

核桃物候期与叶、果表型可塑性研究

大尺度范围内研究‘清香’核桃的物候期和叶、果表型可塑性,探讨气候变化对核桃物候期的影响,为核桃跨区域优质栽培和理解核桃种群分化提供参考。以中国暖温带栽培区、北亚热带栽培区和南亚热带栽培区的‘清香’核桃为研究对象,观测不同栽培区‘清香’核桃的物候期和复叶、单枝多果率和坚果果面特征等表型可塑性。不同栽培区‘清香’核桃遗传相似系数总体平均值为0.998,说明其纯度较高;从暖温带栽培区到南亚热带栽培区迁移栽培过程中,各区域‘清香’核桃物候期顺序一致,但果实发育时间从125天延长至150天;复叶小叶数从5~9片渐变为5~11片,侧叶由椭圆形叶尖锐尖渐变为长椭圆形叶尖渐尖;单枝多果率从2.22%增加至7.43%;坚果果面刻纹和刻窝逐渐增多增深。‘清香’核桃从暖温带到北亚热带再到南亚热带迁移栽培过程中,生长期延长,叶片逐渐由圆变长,叶尖变尖,单枝坐果数逐渐增多,坚果表面光滑程度减弱,物候期和叶、果均表型出了较强的表型可塑性。由其表现出的核桃向泡核桃转变的趋势推测,核桃和泡核桃2个种的分化可能是由环境因子所致。

IL15/PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建

将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和NcoI/SalI双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列.

云南甜龙竹和黄竹种子灭菌条件和萌发特性初步研究

目的]筛选云南甜龙竹和黄竹种子最佳表面灭菌条件,研究其萌发特性。[方法]筛选NaClO(2%、3%、4%)与HgCl_2(0.01%、0.1%)最佳消毒浓度组合;采用流水冲洗时间(6、12、18 h)、2%NaClO浸泡时间(5、10、15 min)和0.1%Hg Cl_2浸泡时间(5、10、15 min),设计正交试验实验,探讨2种竹种最佳表面灭菌处理的时间组合,并对竹种分别在滤纸、MS培养基以及经3 mg·L^(-1)GA_3浸泡后在MS培养基上的发芽率进行了探讨。[结果]NaClO、Hg Cl_2最佳消毒浓度组合为2%NaClO+0.1%HgCl_2;2种竹种最佳表面灭菌时间组合均为:流水冲洗6 h、2%Na Cl O浸泡10min、0.1%HgCl_2浸泡15 min,经此处理后云南甜龙竹和黄竹的发芽率分别为84.4%、72.2%,污染率分别为18.7%、29.6%。不同处理种子萌发率差异t检验结果显示:2种竹子种子是否经过3 mg·L^(-1)GA_3浸泡,对其在MS培养基上的发芽率无显著影响,但种子在MS培养基上的发芽率显著高于滤纸上的发芽率。经相同处理黄竹的发芽率均低于云南甜龙竹。[结论]云南甜龙竹、黄竹最佳表面灭菌组合均为:流水冲洗6 h、2%NaClO浸泡10 min、0.1%HgCl_2浸泡15 min;3 mg·L^(-1)GA_3浸泡处理对云南甜龙竹和黄竹种子在MS培养基上的发芽率无显著影响,但MS培养基上种子的发芽率显著高于其在滤纸上的发芽率。

屏边空竹四季出笋及幼竹生长发育规律研究

[目的]揭示屏边空竹的发笋、退笋和幼竹生长规律。[方法]定点观测了30丛屏边空竹周年的出笋、退笋、秆高及地径生长数据,运用SPSS软件分析评价了不同季节出笋及幼竹生长规律。[结果](1)屏边空竹笋期历时9个月左右(从9月至次年5月),根据出笋量的差异可分为初期、盛期和末期,春季最多而夏季最少;其中5丛(16. 67%)每季出笋,具有四季发笋的习性。(2)退笋率随着笋期逐渐增加,在出笋末期达到最高,为87. 76%。(3)笋-幼竹高生长约130 d完成,平均秆高达6. 36 m;呈现"慢-快-慢"的生长规律,生长曲线可用三次曲线方程描述:H=0. 806-0. 029t+0. 001t2-5. 894×10-6t3,R2=0. 980。(4)地径的生长历时16 d左右,平均地径为18. 50 mm,也呈现"慢-快-慢"的生长规律。[结论]屏边空竹发笋期长约9个月,具有四季发笋的习性,但各季节出笋量差异显著;秆高和地径呈现"慢-快-慢"的生长规律。

巨龙竹秆形发育过程实时荧光定量PCR内参基因的筛选

[目的]利用荧光定量PCR(q RT-PCR)和表达分析软件筛选适用于巨龙竹秆形发育研究的q RT-PCR的稳定内参基因。[方法]应用常规PCR和q RT-PCR,分析EF-1α、GAPDH、Actin、Tubulin、TIP-41、PP2A共6个内参基因在不同秆形巨龙竹("通直型"和"弯曲型")竹笋3个不同发育时期的表达情况。利用Ge Norm、Norm Finder软件对各内参基因的表达稳定性进行评估;以筛选的内参基因对巨龙竹木质素合成中的PTAL基因的表达量进行定量分析,验证所筛选内参基因的有效性。[结果]PCR和q RT-PCR的结果表明,6个候选内参基因PCR目的片段电泳条带单一,熔解曲线具有明显的单一峰。内参基因Actin、EF-1α、GAPDH的稳定性和相关性表现最佳;以它们为内参,对茎秆发育过程中PTAL基因进行定量分析,结果显示它们均具有高效性。[结论]Actin、EF-1α、GAPDH可以作为巨龙竹秆形发育研究中目的基因定量分析的内参基因。为进一步分析巨龙竹秆形发育过程中关键基因表达量的变化提供研究基础。

抗虫杀菌融合基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的基因(Bacillus thuringiesis,简称Bt)通过甘氨酸接头(Gly4Ser)3与一种人工合成的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)基因与相融合,编码一种新的杀虫,并具有抗菌的蛋白。把融合基因(NAMP-Bt)连接到原核表达载体pET-28a和植物表达载体pBI-121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明含有融合基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功,并将该融合基因转入烟草,已获得抗性小植株。

基于种子无菌苗的云南甜龙竹组培快繁研究

云南甜龙竹(Dendrocalamus brandisii)是优异的笋材两用大型丛生竹种,但常规无性繁殖技术培育的苗木因价格高而极大地阻碍了该竹种的推广栽培。文章以云南甜龙竹种子萌发的无菌苗为外植体,研究植物生长调节剂对试管苗快速繁殖及生根的影响。结果表明:丛生芽诱导的最佳培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3.0 mg/L+萘乙酸(NAA)0.7 mg/L,诱导率可达86.33%;最佳继代增殖培养基为MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 6.0 mg/L+噻苯隆(TDZ)0.001 mg/L,增殖系数可达4.90;最佳生根培养基为1/2MS+NAA 2.0 mg/L+吲哚丁酸(IBA)4.0 mg/L,生根率可达71.45%。研究结果可为云南甜龙竹工厂化育苗提供技术支撑。