牛诺瓦病毒和牛轮状病毒双重RAA-LFD快速检测方法的建立及应用

为建立能同时检测牛诺瓦病毒(bovine norovirus,BNoV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)的重组酶辅助扩增-侧流层析试纸条(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick,RAA-LFD)快速检测方法。本试验按照RAA引物探针设计原则,分别针对BNoV RdRp基因和BRV VP7基因的保守区设计引物和探针,制备标准重组质粒,建立并优化RAA-LFD反应体系,同时对该检测方法进行特异性、敏感性及重复性评估,用建立的RAA-LFD法与PCR法、qPCR法分别对采集的168份腹泻犊牛的临床样本进行平行检测。结果显示,该方法可在20 min,39℃的条件下扩增目标片段,对BNoV和BRV敏感度均为103 copies·μL^(-1),与PCR的检测结果基本一致,且与牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)无交叉反应,虽低于qPCR检测结果,但可通过肉眼直接观察试纸条的检测结果。综上所述,RAA-LFD法灵敏度较高、且简便、快速、同时不依赖于仪器、专业操作人员,适用于现场检测。

内蒙古自治区四子王旗马铃薯田蚜虫群落组成

中国马铃薯生产常遭受病毒病影响,蚜虫是马铃薯病毒病传播重要媒介。2021与2022年7月和8月,在内蒙古自治区乌兰察布市四子王旗使用黄板和黄皿诱蚜器采集马铃薯田蚜虫,进行种类鉴定和群落结构分析。当地马铃薯田蚜虫共计18属24种。其中,桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni)、棉蚜(Aphis gossypii)、桃蚜(Myzus persicae)、豆蚜(A.craccivora)、苜蓿无网蚜(Acyrthosiphon kondoi)、奇异粗腿蚜(Macropodaphis paradoxa)、荻草谷网蚜(Sitobion miscanthi)及禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)为优势种。根据蚜虫群落多样性指数、丰富度指数及均匀度指数分析可知,优势种群相对数量随时间增长变化较小,表明该地区马铃薯田蚜虫群落构成相对稳定。研究结果有助于当地开展马铃薯田蚜虫监测和防治工作。

内蒙古自治区克什克腾旗马铃薯田有翅蚜迁飞动态

病毒的传播给马铃薯产业带来的危害无疑是毁灭性的,蚜虫作为马铃薯病毒传播的主要介体,对其种类及发生动态的研究显得尤为重要。研究于2014和2015年,在内蒙古自治区克什克腾旗马铃薯田分别使用黄皿诱蚜器和黄板对马铃薯田有翅蚜进行采集、种类鉴定及发生动态分析。内蒙古自治区克什克腾旗马铃薯田有翅蚜共计15属,24种,其中甘蓝蚜、桃蚜、玉米蚜及棉蚜为优势种。平均温度对有翅蚜数量变化存在影响,在最适温度范围内,随着平均温度的升高,有翅蚜数量有所增加,反之,有翅蚜数量下降。试验所得关于马铃薯田有翅蚜发生动态基础数据,对于后期开展蚜虫有效防控具有重要参考意义。

内蒙古自治区察哈尔右翼中旗马铃薯田有翅蚜种类及迁飞动态

蚜虫作为马铃薯田的重要害虫,近年来给中国马铃薯生产造成了严重的损失。2022年,在内蒙古自治区察哈尔右翼中旗采用黄皿诱蚜器开展马铃薯田蚜虫种类及其有翅蚜迁飞动态研究。共采集到20种有翅蚜,分属于16属。其中,桃粉大尾蚜(Hyalopterus pruni)、桃蚜(Myzus persicae)、玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)为优势种。优势种蚜虫迁飞有2个发生高峰期,首个高峰期为6月中旬至7月中旬,诱集量8.2~9.2头/皿;第2次迁飞峰期为7月下旬至8月上旬,诱集量6.1~10.3头/皿。桃粉大尾蚜的迁飞要稍早于桃蚜和玉米蚜,玉米蚜的2次迁飞高峰期的间隔时间较短。研究结果有助于了解内蒙古自治区察哈尔右翼中旗蚜虫种类和迁飞动态,为蚜虫监控预警提供科学依据。

猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

通过生化试验、药敏试验、PCR分型、毒力基因的PCR检测及动物试验对分离的猪源链球菌进行药物敏感性、血清型和分子流行病学初步研究。从不同省份猪链球菌病疑似病例猪的心血、肝、淋巴结、脑和关节液组织分离出97株链球菌,药敏试验结果表明各菌株对13种抗菌素的耐药谱不同,但对先锋霉素V和环丙沙星的耐药率均低于5%。通过对分离菌株进行PCR鉴定和分型,确认26株为猪链球菌,其中1株为1型,16株为2型,4株为7型,没有9型,另5株为其它型。进一步对1型、2型和7型猪链球菌mrp、epf和sly3种毒力基因的分布情况进行了PCR检测。动物试验表明能100%致死小白鼠的猪链球菌基因型均为epf+mrp+sly+2型猪链球菌,1株2型和1株7型猪链球菌均能复制出典型的猪链球菌病例。

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。

结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备结核分枝杆菌(Mtb)rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白。将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE和westernblot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性。以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础。

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。

与结核分枝杆菌PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的宿主蛋白的筛选

为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(在5'端引入了以编码烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点的序列连接的ZZ和Flag标签序列),构建诱饵重组质粒pcDNA-PE25-PPE41和pc DNA-PE35-PPE68。分别将构建的诱饵重组质粒转染293T细胞后提取细胞总蛋白,经ZZ和Flag标签蛋白两步串联亲和层析钓取宿主蛋白,SDS-PAGE电泳分离后切取差异蛋白胶条进行质谱分析,结果显示,PE25/PPE41鉴定到15个差异蛋白,PE35/PPE68鉴定到29个差异蛋白,并分别挑选了与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的3个和7个差异蛋白,为进一步验证与PE25/PPE41和PE35/PPE68直接作用的宿主蛋白及研究其生物学功能奠定了基础。

鸡肠炎沙门氏菌转座突变体库的构建及减毒菌株的筛选

为筛选减毒肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)菌株,本研究以含有Mini-Tn5转座子的重组自杀质粒pUT对S.enteritidis SM6株进行转座诱变,利用双亲本滤膜杂交方法与供体菌E.coliβ2155进行接合转移,构建并优化接合转移体系,利用卡那抗性和DAP营养缺陷培养平板筛选法构建了SM6的随机转座突变体库。其中包含5个子库,共计获得364株突变体,经PCR鉴定表明转座子均插入SM6株的基因组中。通过Caco-2细胞侵袭试验筛选S.enteritidis侵袭力减弱并在细胞内增殖受到抑制的减毒突变株,经初筛及验证最终获得3株稳定减毒菌株,为进一步研究减毒菌株突变毒力基因的定位及SM6株的侵袭及感染机制奠定了基础。

牛副结核分枝杆菌的分离及鉴定

为进一步确定新疆某奶牛场疑似感染副结核病的病原菌,本研究采集了37头疑似患病奶牛的直肠刮取物,应用卵黄琼脂培养基对其进行分枝杆菌的分离培养,经菌落形态观察、抗酸染色以及多重PCR等方法对分离菌进行病原学鉴定,并利用副结核分枝杆菌亚型鉴定引物进行PCR扩增及测序分析。结果显示,分离培养的7株分离菌均为抗酸染色阳性的分枝杆菌;经多重PCR鉴定,其中3株谱型与副结核分枝杆菌k10参考株一致;进一步通过基因分型的PCR扩增及测序分析,确定这3株分离菌均为牛副结核分枝杆菌。本研究为进一步开展该菌病原学和流行病学研究提供了必要的研究资料。

GC-MS法测定减肥类保健食品中五种非法添加物

建立气相色谱-质谱联用法(GC-MS)测定减肥类保健食品中西布曲明、脱氢表雄酮、美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀5种非法添加物含量的方法。减肥产品经10 mL乙腈超声提取15 min,以5 mL水、2 g氯化钠液液萃取净化,80℃氮吹浓缩后采用GC-MS-SIM进行定量分析。结果表明:5种目标物在0.01~2.00µg/mL浓度范围内呈现良好线性关系,相关系数r均大于0.999,方法检出限为0.01 mg/kg,定量限为0.05 mg/kg。在3个加标水平下目标物的平均回收率为92%~106%,平行6份的相对标准偏差(RSD)为2.4%~5.7%。此方法高效便捷、灵敏度高、稳定性好,适用于减肥类保健食品中5种非法添加物的含量测定。

结核分枝杆菌rv0394c基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其粘附特性的鉴定

本实验室前期研究鉴定出结核分枝杆菌的rv0394c基因产物具有透明质酸酶的活性,但对于该酶在分枝杆菌致病中的作用尚不清楚。为了鉴定该蛋白对细胞是否具有粘附特性,本研究利用大肠杆菌表达纯化的重组蛋白RV0394c与人肺泡上皮细胞(A549细胞)互作,通过激光共聚焦显微镜观察到蛋白对细胞的特异性粘附。为进一步验证该试验结果,将rv0394c基因克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒p MV262中,将重组质粒电转化于非致病性的耻垢分枝杆菌中进行表达。构建的重组菌与A549细胞进行互作,结果表明重组菌可以粘附于A549细胞表面,而且这种粘附能够被RV0394c重组蛋白所阻断,这些结果表明RV0394c蛋白具有粘附细胞的能力,属于该菌的粘附蛋白之一。RV0394c蛋白粘附特性的鉴定为进一步研究该蛋白在致病性中的作用提供了实验依据。

副结核分枝杆菌MAP1588C蛋白的原核表达与抗原性分析

从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的Western blot验证了纯化蛋白产物;另外,副结核阳性牛血清可检测到该蛋白条带。结果表明,表达的重组蛋白MAP1588C的蛋白分子量为21 kDa,具有良好抗原性,有望将此抗原用于建立副结核的ELISA诊断方法。

结核分枝杆菌rv0199基因在耻垢分枝杆菌中的表达及检测

为研究结核分枝杆菌(M.tb)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重组蛋白标签,命名为pMV262。使用Ms/pMV262表达系统对rv0199基因进行超表达,用抗6His标签抗体和抗StrepⅡ标签抗体均能特异的检测到重组蛋白。本试验改造的pMV262穿梭表达载体可很方便的检测M.tb的基因在Ms中的异源表达,不用制备针对蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。构建的重组菌Ms/262-99为进一步研究rv0199基因的功能提供了材料,奠定了基础。

沙门氏菌菌蜕佐剂增强结核分枝杆菌4种蛋白的免疫作用研究

探究肠炎沙门氏菌菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4种抗原的免疫增强作用,本研究以MTB中的Rv3802、Rv0394c(SEC)、Rv0199及E6c10(ESAT6与CFP10融合蛋白)蛋白为免疫原,应用小鼠模型评价沙门氏菌菌蜕对MTB4种抗原的免疫佐剂效应。结果显示,蛋白加菌蜕佐剂组可以刺激小鼠产生持久高水平的抗体,并且菌蜕佐剂的免疫增强效果高于弗氏不完全佐剂;IgG1/IgG2a的比率增高,提示蛋白加菌蜕佐剂组小鼠趋向于Th2型免疫反应,同时可以诱导淋巴细胞分化为CD4+T细胞亚群并产生IFN-γ及IL-4细胞因子;病理组织学显示以菌蜕佐剂配伍蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的安全性。本研究为结核病的预防和新型疫苗的研发奠定了一定的基础。

结核分枝杆菌三基因融合表达的亚单位疫苗研究

为筛选出安全、有效的抗结核分枝杆菌感染的亚单位疫苗,本研究选择了9个结核分枝杆菌的重要抗原(Rv0199、Rv0394c、Omp A、Rv3802c、Ag85a、TB10.4、Rv2660c、Rv0125、Mpt51),利用小鼠模型评价其免疫效果。每3个抗原一组串联融合表达,将其分别与弗氏不完全佐剂及沙门氏菌菌蜕混合,共分成7组,通过皮下注射的方式免疫小鼠,共免疫3次。每次免疫后两周检测其血清抗体分型与效价、脾脏淋巴细胞的分化及其细胞因子的分泌。结果表明,这些融合蛋白均能够刺激机体产生高滴度的抗体,具有较强的免疫原性,其中融合蛋白Rv0199-Rv0394c-Omp A在一免后2周即可以刺激机体产生较高滴度的抗体。抗体分型结果显示,除阴性对照组外,其余组小鼠血清中Ig G1的滴度均高于Ig G2a。并且机体的免疫反应倾向于体液免疫。其中,沙门氏菌菌蜕的佐剂作用与商品化的弗氏不完全佐剂免疫效果一致。本研究为研制结核分枝杆菌亚单位疫苗奠定了基础。

牛布鲁氏菌A19号疫苗免疫血清几种检测方法的比较

为选择科学适用的牛布鲁氏菌病净化检测方法,对1721份免疫布鲁氏菌A19号疫苗18个月后的牛血清,分别用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)、间接酶联免疫吸附试验(iELISA)和荧光偏振试验(FPA)5种血清学检测方法,以及环介导等温扩增技术(LAMP)和荧光定量PCR病原学检测方法进行检测,分析比对不同检测方法的特异性、敏感性、误诊率、漏诊率、符合率、Kappa值等。结果显示:与SAT相比,其他4种血清学检测方法的敏感性、特异性和符合率从高到低依次为iELISA、FPA、cELISA、RBT,其中敏感性均在85.00%以上,特异性均在97.60%以上,符合率均在97.50%以上,Kappa值均≥1.00;与PCR相比,LAMP方法敏感性低(9.09%),但特异性强(99.65%),与PCR符合率高(98.49%)。结果表明:血清学检测方法较为敏感特异,符合率和一致性均较高,而分子生物学检测方法特异性强,不易误诊和漏诊。因此,对于牛群的布鲁氏菌病净化,要结合牛群污染和免疫情况以及净化的不同阶段选择适用的检测方法,仅用一种方法可能会存在偏差。建议先用iELISA或FPA或RBT进行初筛,再用c ELISA或SAT进行确诊,进而对确诊为阳性牛的阴道拭子或奶样进行分子生物学检测,以确定是否存在布鲁氏菌感染。本研究为免疫牛群的布鲁氏菌病净化检测方法选择提供了参考。

关于地理国情监测若干问题的思考

地理国情监测是国家基本国情监测的重要组成部分,是为更好地改善生态环境,促进地理信息产业稳定可持续发展的基础依据。当前全国地理国情监测第一次普查工作已经全面完成,正在开展数据整理分析和统计工作,如何利用好普查数据开展科学分析,进而为制定科学全面系统的普查报告,为后续地理国情监测工作的顺利开展奠定基础,是当前需要认真考虑的问题。本文对地理国情监测若干问题进行全面分析,并提出了具体的意见,以期为相关课题的研究和实践提供借鉴。

参观仿生恐龙展览

今天春节,我和爸爸一同去市展览中心,参观仿生恐龙展览。不一会儿,到了展览馆。只见外面停车场上停着许多大大小小的车辆,看来到这里参观的人还不少呢!步入展览馆,首先映入眼帘的是许多宣传栏。