EF手图像超家族成员——肌钙蛋白C的研究进展

EF手图像超家族蛋白泛指一类含有由螺旋区-泡区-螺旋区构成的EF手图像模体的蛋白。这类蛋白通常都具有金属离子结合能力或者形成二聚体的能力。肌钙蛋白C是一种EF手图像蛋白,它具有钙离子结合能力,可以与肌钙蛋白I、肌钙蛋白T形成复合物调节肌肉收缩。目前,国内外对肌钙蛋白C的研究多数集中在脊椎动物上,而对无脊椎动物的研究较少。主要从EF手图像超家族的特性及其家族成员——肌钙蛋白C的分类、结构及功能等方面进行了阐述,并结合笔者自身的研究方向,简要介绍了家蚕肌钙蛋白C的研究情况及前景。

学科竞赛驱动的应用型本科生培养模式的探索

人才培养是大学的本质职能,本科教育是大学的根本,在高等教育中是具有战略地位的教育、是具有纲举目张意义的教育。坚持“以人为本”,推进“四个回归”,全面提高人才培养能力,是实现民族复兴的重要任务之一。研究主要探讨在现行“双创”背景下,如何培养合格的应用型本科人才,为地区产业发展提供重要的人才储备。实践证明,建立“兴趣聚集,竞赛驱动”的培养模式,可以提升学生的专业知识水平和科研素质,拓展学科视野与科研思维,培养学生的创新精神和实践能力,带动学生自我提升的自觉性,增强专业自信,全面提升学生的创新创业能力。

泉港石化工业区园林绿化更新构想

以泉港石化工业区为研究对象,在调查其园林绿化现状的基础上,从规划布局、绿化树种选择、模式构建和设计要点等方面,探讨了泉港石化工业区的园林绿化更新。

泉港石化工业区园林植物配置调查分析

园林绿化建设对于弱化石化工业区外显特征、修复遭受破坏的自然生态环境、构建生态园林式企业空间具有十分重要的意义。文章以泉港石化工业区为研究对象,针对其园林植物配置现状,从植物应用种类、配置模式、绿化效果等方面进行多角度的分析,总结了泉港石化工业区园林植物配置中存在的突出问题,探讨了相应的设计提升技术要点,以期为其后续的提升改造提供参考和借鉴。

添加蚕蛹油对小鼠口服葛根素吸收效果的影响

为了提高葛根素口服制剂的生物吸收效果,采用研磨法将葛根素与蚕蛹油制成均质混悬剂,采用高效液相色谱法测定小鼠灌胃该混悬剂(葛根素剂量为200 mg/kg)后不同时间点取样血清中葛根素的含量,分析添加蚕蛹油对小鼠口服葛根素生物利用度的影响。试验结果表明,该测定方法的精密度相对标准偏差(RSD)<15%,符合生物样品定量分析方法指导原则的要求;葛根素血清标准品溶液稳定性良好,可用于葛根素生物利用度的分析。建立的药-时曲线数据经DAS软件处理显示:对照组的tmax、Cmax和AUC0～10 h值分别为(35.83±5.48)min、(0.79±0.18)μg/mL、(1.79±0.10)μg.h/mL;试验组的tmax、Cmax和AUC0～10 h值分别为(35.71±4.08)min、(3.72±0.68)μg/mL、(7.00±1.03)μg.h/mL,葛根素的相对生物利用度为391%。根据上述测试与分析结果认为,添加蚕蛹油可以显著提高小鼠对葛根素的口服吸收效果。

家蚕膜蛋白基因(BmTmC27)的序列分析及组织特异性和原核表达

从家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条家蚕膜蛋白基因序列,通过编码氨基酸序列的同源性比对表明其可能是家蚕的未知功能序列,命名为BmTmC27(GenBank登录号:DY231073.1)。生物信息学分析结果表明该基因全长833 bp,由558 bp的开放阅读框、102 bp的5'端非翻译区和173 bp的3'端非翻译区组成,编码蛋白由185个氨基酸组成且含有4个跨膜区,预测蛋白分子质量为20.94 kD,等电点为7.38。将该基因片段与BmNPV的polh基因连接后克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核融合表达载体pGEX-4T-1-polh-BmTmC27,经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白以包涵体形式在E.coli BL21(DE3)中表达。利用多角体蛋白可溶于碱性环境的性质,采用调节pH值的方法纯化融合表达的重组蛋白GST-Polh-BmT-mC27,然后经TEV酶消化获得BmTmC27蛋白。荧光定量PCR分析BmTmC27在家蚕5龄幼虫不同组织中的表达存在明显差异,其中在脂肪体、中肠和气管中的转录水平较高。利用GST沉降技术研究了BmTmC27的互作蛋白,与对照组相比,发现了4条特异性互作蛋白条带。研究结果有助于进一步探究BmTmC27的生物学功能,也为膜蛋白的表达和纯化提供了一种新方法。

丙种球蛋白联合阿司匹林在川崎病合并冠脉扩张患儿治疗中的效果分析

目的:评价丙种球蛋白联合阿司匹林治疗川崎病合并冠脉扩张患儿的效果和价值。方法:选取2017年1月—2022年6月我院收治的26例川崎病合并冠脉扩张患儿,采用简单随机抽样法分为对照组与观察组,各13例,对照组给予阿司匹林治疗,观察组阿司匹林联合丙种球蛋白治疗,比较两组症状消失时间、血小板聚集相关因子、炎症因子水平以及免疫功能指标水平和不良反应发生情况。结果:观察组发热等各项症状消失时间均短于对照组(P<0.05)。治疗8周后,观察组PLT、WBC、ESP、CRP、IL-6、TNF-α水平均低于对照组(P<0.05)。治疗8周后,观察组Th17水平低于对照组,Treg水平高于对照组(P<0.05)。两组不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在川崎病合并冠脉扩张患儿治疗中,采用丙种球蛋白联合阿司匹林联合用药方案,疾病症状可在短时间消退,能改善血小板聚集相关因子、炎症因子以及免疫功能指标水平,且联合用药不良反应未见明显增加。

家蚕JAB1/CSN5蛋白的基因克隆表达及亚细胞定位

JAB1/CSN5是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalosome CSN)的第5个亚基,内嵌的JAMM基序是CSN参与蛋白的泛素化降解途径并调控生物体生长发育过程的异构酶活性位点。在家蚕蛹cDNA文库中筛选到的一条基因序列,其ORF长度为1047 bp,预测编码蛋白含有JAB1/CSN5保守结构域JAB-MPN,因此命名为BmJM。将BmJM基因的ORF插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmJM,于E.coliRosetta菌中进行原核表达,重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得BmJM的多克隆抗体,采用RT-PCR、Western blotting方法对BmJM基因在家蚕不同发育时期和组织中的转录及蛋白表达水平进行分析,发现BmJM蛋白在家蚕5龄幼虫的生殖腺表达量最高,而在其他组织中表达量较少,由此初步揭示了JAB1/CSN5在家蚕生长发育过程中的作用。亚细胞定位测定表明BmJM蛋白在细胞质近核区域含量最高,在细胞核中也有分布。

豆粕饲料综合利用的现状与前景

豆粕是大豆加工过程中产生的副产品,豆粕中蛋白质质量分数高达45%且碳水化合物与氨基酸等物质也极为丰富,再加上豆粕的价格相对低廉,在动物饲料方面发展前景十分广大。但是由于豆粕中含有多种抗营养因子导致豆粕中的营养无法被动物吸收,甚至会对动物产生危害,所以使得豆粕在动物饲料方面的应用受到了严重的阻碍。近些年有研究发现,豆粕通过发酵可以有效地除去这些抗营养因子,从而使得豆粕中营养能被动物更好的吸收,这让豆粕饲料的研究变得火热起来。概括了目前国内外研究人员对于豆粕饲料综合利用的相关研究现状,希望通过对前人方法的总结与概括,为豆粕饲料的综合开发利用提供帮助。

间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25是间日疟原虫有性生殖期表达的表面蛋白,可以抑制疟原虫在媒介按蚊体内的有性生殖及孢子增殖,有效地阻断疟疾病原从按蚊向人体的传播。为了探索该疫苗高效、低成本生产的新途径,进行了Pvs25在家蚕杆状病毒表达系统中表面展示表达的初步试验。首先将经过非功能区去除和密码子优化的间日疟原虫Pvs25基因克隆至转移载体pFastBacHTb,构建重组质粒pET32a-Pvs25并转化E.coli Rosetta菌株,诱导后成功表达了Pvs25蛋白,利用Ni-NTA亲和层析的方法纯化重组Pvs25蛋白,免疫BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,利用Protein A抗体纯化柱纯化后的抗体经间接ELISA法测定其效价为1∶12 800;利用Bac-to-Bac系统构建含Pvs25基因的重组杆状病毒vBmPvs25,接种BmN细胞和家蚕5龄幼虫,经SDS-PAGE与Western blotting分析表明Pvs25在BmN细胞和幼虫中均成功表达;构建vBmgp64-CMV-Pvs25表面展示重组病毒,检测到Pvs25在BmN细胞中表达并展示于细胞和杆状病毒囊膜上。研究结果为利用家蚕杆状病毒表达系统生产间日疟疾传播阻断候选疫苗奠定了一定的试验基础。

家蚕膜蛋白基因BmMFS的组织表达特征和重组蛋白的表达

膜蛋白在生物体内承担细胞内外环境物质和能量的交换及信息传递,也是药物设计的靶标。在家蚕蛋白质数据库中筛选到一个含有6个跨膜区的膜蛋白,包含一个主要协助转运蛋白超家族(MFS)的保守结构域,将该蛋白质的编码基因命名为BmMFS。荧光定量PCR检测家蚕5龄幼虫不同组织中的BmMFS转录水平存在明显差异,在中肠中的转录水平最高,在气管中的转录水平最低。以家蚕蛹cDNA为模板扩增BmMFS片段,构建重组质粒pET-32a-Ph20-BmMFS,在Ph20和BmMFS序列之间引入凝血酶(thrombin)酶切位点;转化E.coli Rosetta,以1 mmol/L IPTG诱导融合基因表达,菌液调节pH初步纯化后进一步通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白质,经Western blotting和质谱鉴定获得的融合蛋白为Ph20-BmMFS;进一步利用家蚕杆状病毒表达系统构建重组病毒(vPh20-BmMFS)并感染BmN细胞,Western blotting检测显示融合BmMFS蛋白成功表达。将家蚕膜蛋白基因与家蚕杆状病毒多角体蛋白基因片段Ph20融合表达,提高了膜蛋白在原核和真核表达系统中的表达量,利用该多角体蛋白能在较低pH条件下溶解的特性简化了融合蛋白纯化过程。

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为:睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。

柞蚕滞育关联蛋白基因dap2的表达特征及分子特性

滞育关联蛋白(DAP)在昆虫滞育进程中可能发挥重要作用。从NCBI获取柞蚕滞育关联蛋白基因2(Antheraea pernyi diapause-associated protein 2,dap2)的序列,序列分析表明该基因的cDNA全长1 187bp,ORF为874bp,编码278个氨基酸。NCBI数据库氨基酸序列比对,DAP2与烟草天蛾和家蚕的眼色素结合蛋白(omminbinding protein,OBP)同源性分别达到57%和58%。通过荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测柞蚕不同发育时期和五龄幼虫不同组织中dap2的转录表达水平,结果表明dap2在滞育蛹中转录和表达水平最高;在5龄幼虫不同组织中的分析表明其转录水平在脂肪体和血淋巴中最高,在翻译水平上血淋巴中表达最高。分离纯化后,对天然DAP2蛋白分子特性进行初步研究,吸收光谱分析不能表明其携带色素,去糖基化修饰分析表明其为糖蛋白,双向电泳表明其可能存在三种不同程度的翻译后修饰,推测其可能是柞蚕的一种眼色素结合蛋白(ommin-binding protein,OBP)。

条纹斑竹鲨的抗乙肝表面抗原的单域抗体筛选与重组抗体活性探究

对免疫HBsAg-ad亚型抗原的条纹斑竹鲨中血清、脾脏和淋巴细胞进行多组学测序结果综合分析筛选出特异性序列,构建重组表达质粒pET-Duet-his-sumo-Anti-HBsAg-S1、pET-Duet-his-sumo-Anti-HBsAg-S2,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),并诱导表达以及纯化重组单域抗体,通过ELISA和细胞水平检测重组单域抗体的活性。结果表明:通过生物信息学分析筛选出2条特异性序列,在16℃、0.5 mmol/L诱导剂条件下可获得2 mg/mL以上的重组蛋白;ELISA检测显示均与HBsAg具有较好的结合力,细胞水平活性分析得到Anti-HBsAg-S1具有较好的病毒抑制效果和生物学活性。该研究结果为其他抗原的特异性抗体筛选提供理论参考。

家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究

利用杆状病毒表面展示技术,构建展示SARS-CoV的棘突蛋白(spike protein)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的重组杆状病毒vBmgp64-RBD,并进一步研究其展示目的蛋白的免疫原性。结果表明:RBD蛋白正确表达并成功展示在病毒囊膜表面,将灭活的纯重组杆状病毒vBmgp64-RBD皮下注射BALB/c小鼠能产生抗RBD蛋白的特异性抗体,且抗体具有抗RBD蛋白的中和作用。证明vBmgp64-RBD有可能作为一种基于杆状病毒的新型SARS疫苗,为SARS的体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础。

研究型教学模式在生物制药本科专业综合实验中的探索与应用——以抗菌肽的高效制备与活性分析为例

通过设计本科综合实验教学项目抗菌肽的高效制备与活性分析,针对研究型教学元素对教学内容、教学方法和考核模式进行了优化改革,以学生的自主实验探索与学习为中心,着重培养学生分析问题和解决问题的能力,强化对学生创新性思维能力的培养。研究型教学模式的探索和应用对提高生物制药本科生的综合实验能力和科研思维训练具有重要的作用,有利于学生更好地适应新时代生物制药产业发展对高素质生物医药人才的需求。

家蚕一种富含半胱氨酸蛋白基因BmCRP的原核表达与定位研究

从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。

家蚕脂围蛋白(PLIN)基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。