产纤维素酶工程菌株的构建及其在醇化烟叶中的应用

烟叶中过高的纤维素含量使烟叶组织容易破碎,影响加工过程中烟叶的可塑性,使烟叶杂气变重等。为了获得产纤维素酶的优良菌株,实现醇化烟叶纤维素的有效降解,利用同源重组法成功构建了10株纤维素降解的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌株。通过刚果红平板筛选、羧甲基纤维素钠酶活、滤纸酶活及滤纸崩解率等检测,共筛选出C36、CM、KF和GH54株产纤维素酶能力较强的重组菌株。将醇化烟叶作为底物进行纤维素降解,发现重组菌株CM的产纤维酶效率最高,其羧甲基纤维素钠酶活和滤纸酶活分别为39.55和23.52 U·mL-1。结果表明,构建的重组菌株能够利用醇化烟叶中的纤维素产生纤维素酶,可为工业生产中醇化烟叶纤维素降解提供理论支撑。

烟叶果胶研究进展

果胶是烟草植物细胞壁的重要组成成分。作为一种结构与成分具有高度复杂性和多样性的基质多糖,在烤烟生长发育过程中为烟株提供结构框架,并发挥着水势调节、抵御病原物入侵等重要作用。综述了果胶的化学组成、提取方法及其对烟叶外观质量、吸食质量的影响,以及降解果胶的方法,以期为烟叶调制及加工过程中调控烟草原料果胶含量,进而提高卷烟原料品质提供新思路。

HPLC-MS/MS法测定烟叶中7种植物内源激素

为获得烟草激素的质量分数数据,并分析其在抗性、生长发育等过程中的作用,采用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)仪建立了同时分析烟叶中吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和油菜素内酯(BR)等7种植物激素质量分数的方法。采用多离子反应检测模式,获得7种植物激素的特征碎片离子峰,并测定了烟草花叶病毒(TMV)感染的烟叶样品。结果表明:(1)7种植物激素在线性范围内的相关系数(r)为0.998 6～0.999 5,方法的检出限为0.07～3.00μg/L,日内日间相对标准偏差(RSD)为0.44%～9.76%,回收率为77.82%～117.63%;(2)烟草花叶病毒感染极显著(p<0.01)地增加了烟叶中SA、IBA、JA、ABA的质量分数,显著(p<0.05)增加了烟叶中IAA的质量分数,同时显著(p<0.05)降低了烟叶中GA的质量分数;TMV病毒感染对BR的影响不大。该方法具有良好的灵敏度、精密度和回收率,可用于植物相关激素的同时分析。

烟草木质素研究进展

木质素是植物细胞壁的重要组成部分,在烟草生长过程中木质素对增强其抗病和抗倒伏能力发挥重要作用。本文对烟草木质素的结构和组成、含量测定、烟草木质素含量的影响因素、木质素含量对烟叶及烟草薄片质量的影响以及烟草木质素的降解方法进行概述,对烟草中木质素脱除或降解研究作了展望。

UPLC-MS/MS法同时测定烟叶中的TSNAs

为快速准确测定烟叶中的烟草特有亚硝胺（TSNAs）,优化改进了LC-MS/MS法中样品的前处理条件,建立了测定烟叶中TSNAs的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。结果表明：1用乙酸乙酯萃取代替固相萃取对TSNAs进行纯化,操作快速准确,更适合大批量样品的分析;2N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-（N-甲基-N-亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）、N-亚硝基假木贼碱（NAB）的定量限分别为4.22、2.38、1.29和0.72 ng/g,加标回收率在87.7%-107.0%之间。

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。

烟草叶绿体基因工程研究进展

叶绿体基因工程通过同源重组实现定点整合,与细胞核基因工程相比,使外源基因的表达更为高效和安全。叶绿体基因工程在模式植物烟草中的研究最为广泛。为此,总结了近年来烟草叶绿体基因工程在提高光合效率、抗性和品质等方面的研究进展,同时对利用该技术在生物反应器中生产生物质酶、次生代谢产物、疫苗和药用蛋白等方面进行了综述。在此基础上,对叶绿体基因工程的研究和应用前景进行了展望。

植物研究中的流式细胞术及其在烟草中的应用进展

流式细胞术作为一种快速、灵敏的细胞分析分选技术,目前已广泛应用于植物学研究的多个领域。为了拓展流式细胞术在烟草研究中的应用范围,介绍了流式细胞仪的工作原理,并阐述了流式细胞术在植物细胞核DNA含量和倍性分析、植物核型分析及分选、细胞分选与其他技术的联合等学科领域的应用概况。在总结流式细胞术在烟草相关研究领域应用现状的基础上,展望了流式细胞术在烟草单细胞组学、病害防治和烟气毒理学检测等方面进一步研究与应用的可能性。

烟草慢阴离子通道蛋白基因NtSLAH1的克隆及表达分析

为了揭示烟草慢阴离子通道蛋白(Slowly activating Anion Channel,SLAC)家族成员在氯离子转运过程中的作用,通过同源克隆的方法从栽培烟草K326中克隆到1个SLAC同源基因(SLAC Homologue),命名为NtSLAH1,其开放阅读框长度为1107 bp,编码368个氨基酸,表达蛋白定位在细胞质膜上。与已报道的其他植物SLAH相比,NtSLAH1与拟南芥SLAH1和SLAH4序列相似性更高、进化距离更近。实时定量荧光PCR(qRT-PCR)结果显示,NtSLAH1在根中的表达量最高,高浓度NaCl处理下其表达量下降,表明NtSLAH1可能在烟草盐胁迫响应及氯离子吸收过程中发挥重要作用。

灰霉病菌侵染垫侵染油菜叶片的超微结构观察

利用透射电镜和扫描电镜观察灰霉病菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染垫侵入油菜叶片的过程。观察结果发现:灰霉病菌顶端菌丝聚集通过形成侵染垫,侵染垫分泌胶状物质降解表皮细胞的细胞壁,菌丝通过破损的表皮细胞进入叶片并在叶肉细胞间及细胞内生长;侵入的菌丝进一步降解叶肉细胞的细胞壁并在叶肉组织中生长繁殖,造成叶肉细胞的细胞质凝聚、细胞器破裂等细胞坏死症状。研究结果表明:灰霉病菌侵染垫通过降解植物细胞壁侵染植物,并且在植物组织内生长过程中也会降解细胞壁,细胞壁的降解在灰霉病菌侵染和生长过程中起着重要作用。

烟草CuZnSOD基因克隆及在低温弱光胁迫条件下的表达模式分析

为进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,从13个烟草品种及林烟草种的幼叶cDNA中成功扩增出CuZnSOD基因编码区全长序列,并对其进行序列分析。烟草CuZnSOD基因编码序列全长291bp,编码1个96个氨基酸长度的蛋白质,其核苷酸序列关键区域与Genbank中其他植物的CuZnSOD相似性高至94%。遗传进化分析结果表明,烟草CuZnSOD基因与西红柿和马铃薯CuZnSOD基因亲缘关系最近。通过荧光定量PCR对低温弱光胁迫条件下13个烟草品种及林烟草种的CuZnSOD基因表达量进行分析,结果显示在低温弱光胁迫条件下,CuZnSOD基因在13个烟草品种及林烟草种间表达模式存在显著差异。对烟草CuZnSOD基因表达模式的分析,有助于揭示烟草对环境的适应机制及抗氧化的生理机制。

烟草NtGGPPS 3基因的亚细胞定位和组织表达分析

为研究烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS 3在烟草萜类物质合成中的功能,构建NtGGPPS 3与GFP融合蛋白的植物表达载体,并通过基因枪法瞬时转化烟草悬浮细胞BY2,研究该基因的亚细胞定位情况,并对该基因在烟草不同生育期不同器官中的表达量进行分析。结果表明:NtGGPPS 3定位在烟草的叶绿体和质膜上;NtGGPPS 3基因在普通烟草主要生育期各组织中均表达,在叶片中表达量较高,在打顶期的茎中表达量明显上升。表明,该基因可能参与叶绿素、类胡萝卜素和质体醌等与光合作用相关萜类化合物的合成,也可能参与激素和防御相关的萜类物质合成。

不同培养条件下纳米碳溶胶对烟草细胞生长的影响

为进一步明确纳米碳溶胶的促生效果及其生理机制,在固体和液体两种培养条件下,以烟草BY-2细胞为试验材料,对纳米碳溶胶处理后细胞生物量、营养元素积累量、水通道蛋白基因和细胞周期蛋白基因的表达量以及悬浮细胞生长特性等指标进行了测定。结果表明,固体培养基中添加纳米碳溶胶能有效促进烟草愈伤组织生长,增加N、P、K养分积累量;其中50mg/L浓度的纳米碳溶胶处理,愈伤组织N、P、K养分积累量增加幅度最大,分别为41.3%、27.6%和47.0%。同时,纳米碳溶胶能显著提高培养前期水通道蛋白基因NtPIP1和细胞周期蛋白基因CycB的表达量,这是其促进愈伤组织生长的基础。在悬浮培养体系中,纳米碳溶胶处理对培养前期和中期悬浮细胞密度、密实体积以及死亡率无显著影响,表现出良好的生物相容性;在培养后期,10mg/L浓度的纳米碳溶胶处理对细胞生长产生一定抑制作用,表现为细胞密度下降和细胞活力降低。可见,纳米碳溶胶对烟草细胞生长的作用效果受培养条件和纳米碳溶胶浓度的共同影响。

UPLC-MS/MS法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸

为更加快速准确地测定烟草中的酸性植物激素,通过优化样品的前处理条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定烟草中脱落酸和茉莉酸的方法。结果表明：1脱落酸和茉莉酸的检出限分别为0.082和0.027 ng/m L,加标回收率均在96.4%-110.8%之间,脱落酸的日内和日间相对标准偏差（RSDs）均低于3.86%,茉莉酸的日内和日间RSDs均低于4.53%。2该方法样品用量仅为25 mg;所采用的负离子检测模式选择性高、干扰小。适用于烟草样品中酸性植物激素内源性水平的准确检测。

灰霉病菌侵染垫生长在不同介质表面上的超微结构

果蔬等经济作物生产中的重要病害——灰霉病是由真菌灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.Fr)引起,灰霉病菌的侵染垫是病菌侵染植物所必需的,试验研究了侵染垫的侵入机制。结果表明,灰霉病菌的侵染垫能在再生纤维素膜(玻璃纸)上生长并能降解该膜,然后侵入其中,在聚乙烯膜上不能生长亦不降解该膜。侵染垫在再生纤维素膜上的生长方式和侵入过程同在植物细胞表面完全一致,可见,植物中的纤维素是诱导灰霉病菌侵染垫形成和生长的重要因素。试验结果为进一步探讨灰霉病菌的侵染机制提供了线索。

固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备及其在4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇的O-糖苷化合物分析中的应用

采用溶胶-凝胶法,以丙烯酰胺作为单体,制备了基于有机-硅胶杂化整体柱的β-葡萄糖醛酸酶反应器。优化了硅酸甲酯和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅的物质的量的比、丙烯酰胺和聚乙二醇的用量,以及水浴温度等制备条件,获得了孔隙均匀、通透性良好、机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱。采用光学显微镜和扫描电镜表征杂化整体柱。进一步将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在整体柱上,以4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)的O-糖苷化合物(NNAL-O-Gluc)为底物研究酶反应器的水解效果,实验结果证明酶反应器在室温条件下的水解效率大大提高,实现了NNAL-O-Gluc高效水解与分析,解决了目前NNAL-O-Gluc分析中前处理水解效率低的问题。

烟草生物技术中国专利申请态势及热点分析

为把握当前烟草生物技术领域的发展状况与发展趋势,使用incoPat数据库对2000—2022年国内烟草生物技术相关专利进行检索,并从申请态势、IPC(International Patent Classification,国际专利分类)小类分布和专利技术领域等方面展开分析。结果显示:①数量及趋势:烟草生物技术领域已进入快速发展期,年均专利申请量为140件。②归属:国内烟草行业在该领域的专利申请具有明显数量优势,以云南省烟草公司的专利数量最多,其次是云南中烟工业有限责任公司、中国烟草总公司郑州烟草研究院和贵州省烟草公司;国外主要以跨国烟草公司的申请为主,其中,美国无烟烟草公司和奥驰亚客户服务公司的申请量最多。③IPC分类:该领域IPC技术主题分布较为集中,主要涉及C12N(微生物及其培养基)和C12Q(测定方法)2个小类,且A01N-A01P-C12R(抗病、杀虫或调节植物生长的生物菌剂)、A01H-C07K-C12N(植物新品种培育或组织培养)是今后专利申请的重点。④研究领域:在具体技术方面,专利申请主要分布在烟草绿色防控、烟草基因作用机制和烟草生物菌剂研发等领域,以烟草绿色防控领域的专利申请最多,内容涉及烟草病毒检测和病虫害生物防治等。

不同醇化卷烟原料表面微生物的群落结构及对大分子物质的降解功能

为探究醇化卷烟原料表面微生物的群落结构及对大分子物质的降解功能,采用宏基因组测序技术分析醇化2年的烤烟烟梗、香料烟和烤烟片烟样品的表面微生物群落结构,并对3种醇化卷烟原料中的果胶、纤维素、淀粉、蛋白质和木质素含量与表面微生物群落组成进行相关分析。结果表明,3种醇化卷烟原料中,醇化烤烟烟梗淀粉和蛋白质含量最低,醇化烤烟片烟果胶、纤维素和木质素含量最低。醇化烤烟烟梗的优势菌属为泛菌属(Pantoea)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和假单胞菌属(Pseudomonas),醇化香料烟的优势菌属为泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter),醇化烤烟片烟的优势菌属为泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)和土地芽孢杆菌属(Terribacillus)。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)含有较多与淀粉降解相关的基因,其相对丰度与醇化样品淀粉含量显著负相关;鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)含有较多与蛋白质降解相关的基因,其相对丰度均与醇化样品蛋白质含量显著负相关;芽孢杆菌属(Bacillus)含有较多与果胶降解相关的基因,其相对丰度与醇化样品果胶含量显著负相关。

烟草抗冷相关基因在两种不同育苗方式下的低温应答差异分析

为探究水旱两段式育苗技术抗低温胁迫的分子机制,利用生物信息学方法分析了烟草低温应答关键转录因子CBF(C-repeatbindingfactor)基因家族的进化关系、基因结构、保守结构域及其启动子顺式作用元件,进一步利用qRT-PCR分析两种育苗方式下(常规漂浮育苗和水旱两段式育苗)NtCBF基因家族、CBF-regulon基因和非CBF-regulon相关基因的低温应答模式。结果表明,NtCBF15~NtCBF21基因与拟南芥CBF5、CBF6基因进化关系相近,NtCBF1~NtCBF14基因与拟南芥CBF1~CBF4基因进化关系相近。NtCBF基因家族成员均具有motif 1/2/4/5保守蛋白结构域,表明该家族在进化过程中较为保守;其中,NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8个基因启动子区具有低温响应元件。低温处理后,NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及CBF-regulon基因中NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3的表达量均显著升高。推测NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及其下游调控基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在水旱两段式育苗抗低温胁迫过程中起重要作用。

烟草IMK基因家族的鉴定与表达分析

为挖掘可能参与烟草花序发育和抗逆胁迫相关的花序分生组织类受体激酶(Inflorescence meristem receptor-like kinase,IMK)基因家族成员,利用生物信息学方法在普通烟草基因组中鉴定出6个IMK基因家族成员,不同成员间的氨基酸序列一致性在61%~97%之间。系统进化树分析显示烟草IMKs主要分为2类,主要区别在于重复motif 12(GSIP motif)的个数差异。跨膜结构域分析显示,2种类型烟草IMKs跨膜结构域分布间存在差异,暗示这2类IMKs可能出现了功能分化。翻译后修饰位点分析结果表明,在拟南芥中鉴定到的IMK2的11个修饰位点,其中只有2个位点在所有烟草IMKs蛋白中均保守,推断这2个位点可能在IMKs蛋白功能发挥的过程中起着重要作用。表达分析表明,大部分IMKs在侧根和花蕾中高表达,而且被GA、IAA等激素诱导上调表达,暗示IMKs蛋白可能参与侧根和花的发育过程,同时也参与GA和IAA介导的调控反应。