改进的90%无血肝切除术与药物诱导建立大鼠急性肝衰竭模型

目的建立理想的大鼠急性肝衰竭(ALF)模型。方法 SD大鼠68只随机分为3组:(1)传统手术组,按Higgins和Anderson法直接套扎肝蒂切除90%大鼠肝脏;(2)改进手术组,采用改进无血肝切除术切除90%肝脏组织;(3)药物组,腹腔注射D-氨基半乳糖(700 mg/kg)+脂多糖(5μg/kg)。观察手术相关情况及建模后7 d大鼠存活率;检测肝功能指标包括谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(Tbil)、白蛋白(ALB)、血氨(NH3)、血糖(Glu)和凝血酶原时间(PT);观察建模后24、72 h肝脏组织病理变化。结果传统手术组术后出血死亡率高于改进手术组(15%vs 0);传统手术组、改进手术组、药物组大鼠建模后7 d存活率分别为0、25%和15%;改进手术组及药物组处理后24、72 h,ALT、Tbi、ALB、NH3、Glu、PT等均出现明显变化(P<0.05),其中ALT、Tbi、NH3、Glu、PT在改进手术组中均在24 h变化最明显,在药物组中均在72 h变化最明显,两组ALB则均在7 d下降至最低值后逐渐恢复;改进手术组残肝及药物组肝脏在24、72 h均出现不同程度的肝细胞变性坏死等表现。结论改进90%无血肝切除术及腹腔注射D-氨基半乳糖+脂多糖均可建立理想的大鼠ALF模型,可适用于不同的ALF相关研究。

基于CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞

目的利用CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的肾集合管上皮细胞,为肾单位肾痨(NPHP)发病机制的研究提供体外细胞模型。方法针对犬NPHP1第5外显子区域设计3对引导RNA序列(sgRNA),构建重组真核表达载体PX459-sgRNA;以脂质体Lipo2000转染犬肾集合管上皮细胞MDCK,嘌呤霉素筛选成功转染细胞。基因测序和脱靶检测以验证敲除位点,分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测敲除靶基因的mRNA和蛋白,显微镜下观察细胞形态变化。以慢病毒转染shRNA敲低NPHP1基因表达的MDCK细胞为对照,同法检测敲低靶基因的蛋白,并观察细胞形态。结果3对sgRNA通过重组真核表达载体,成功转染MDCK细胞。筛选获得1株NPHP1稳定敲除的MDCK细胞,基因测序显示为小片段缺失与移码点突变的复合杂合突变[c.500_551del(p.His167GlnfsTer14)和c.499delC(p.His167ThrfsTer31)]。基因测序显示,8个可能脱靶位点与原位点测序一致,排除脱靶情况。CRISPR/Cas9技术构建NPHP1基因敲除的MDCK细胞NPHP1 mRNA表达下降,NPHP1基因编码蛋白nephrocystin-1表达完全缺失;shRNA技术构建NPHP1基因敲低的MDCK细胞nephrocystin-1表达减低。MDCK细胞聚集分布,呈铺路石样改变;两种技术构建的MDCK细胞外形改变类似,略呈长梭形,细胞间隙稍增大。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建了NPHP1基因稳定敲除的MDCK细胞,将有利于NPHP发病机制的体外研究。

IFT140基因纯合突变致Mainzer-Saldino综合征1例报告并文献复习

目的分析IFT140基因突变致Mainzer-Saldino综合征(MSS)的临床与基因突变特点。方法总结1例临床诊断MSS患儿的临床资料,分析患儿及家系成员的全外显子测序与生物信息学检测结果。结果女性患儿,3岁时出现弱视,5岁8月龄因贫血就诊发现已进入终末期肾病,视网膜退行性病变,指骨骨骺呈锥状改变。基因检测显示IFT140纯合突变(c.634G>A,p.G212R),分别来源于父母。结论MSS有特征性临床表现,基因检测有助于明确诊断。

少年型肾单位肾痨13例临床特点和基因突变分析

目的 探讨少年型肾单位肾痨（NPHP）临床和基因突变特点.方法 收集2010年1月至2016年7月广东省6家医院临床拟诊或病理确诊来自25个家系的27例少年型NPHP患儿的临床资料和外周血标本.所有患儿均行NPHP1基因纯合片段缺失检测,无片段缺失且无眼部受累患儿进一步行NPHP1基因外显子测序;合并眼部受累者先行NPHP5基因外显子测序,无突变者再依次行NPHP10基因和NPHP1基因外显子测序.结果 27例患儿中通过病理和（或）基因检测确诊13例,男4例,女9例.起病年龄8.5（0.1 ～12.8）岁.7例尿常规无异常,6例有少至中量蛋白尿,无持续血尿患儿.就诊时估算肾小球滤过率为（12.7＆#177;10.7）ml/（min＆#183;1.73 m2）.影像学检查：5例患儿见单发或多发肾囊肿,8例未见囊肿;双肾体积缩小9例,正常4例.5例肾活检患儿肾皮髓质交界处见肾小管囊肿形成及小管基底膜增厚分层.2例患儿合并眼部损害,1例有肝功能损害.7例（25.9％）患儿检测到NPHP1基因突变,其中3例为大片段纯合缺失（del2、804/6、del-10,del2、804/6、del-10、del-5、del-9及804/6、del-10、del-5）;点突变4例,均为新突变,预测均可导致NPHP1蛋白结构和功能改变：1例双重杂合突变[c.13 C ＞T （p.Arg5Term）及c.1520 ＋5 G＞A];3例为纯合突变,其中2例来自同一家系[c.1756 C ＞T（p.Arg586Term）],另1例检测到c.1298delA（p.Lys433fs）.1个家系检测到NPHP5基因突变,该家系有2例合并先天性视网膜病患儿.结论 少年NPHP起病隐匿,尿液改变轻微或无改变,肾脏大小正常或缩小,肾囊肿仅见于部分患儿.7例患儿检测到NPHP1基因突变.

91例儿童Alport综合征临床、病理特点及误诊分析

目的探讨儿童Alport综合征(AS)临床、病理特点和诊治情况,以提高对AS的认识。方法收集确诊的91例AS患儿临床资料进行回顾性分析。结果 91例患儿均有血尿,86例伴有蛋白尿。61例X连锁显性遗传AS(XL-AS)患儿有阳性家族史。肾活检的82例患儿中74例有轻度或轻-中度系膜增生,48例系膜区少量免疫复合物,53例肾小球基底膜(GBM)有变薄、增厚和撕裂。63例进行了肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链免疫荧光检测,确诊AS 58例,其中53例符合XL-AS,5例符合常染色体隐性遗传AS。91例AS患儿中,58例通过肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链免疫荧光确诊,21例通过电镜确诊,1例通过皮肤活检确诊;12例基因诊断确诊。发现6个COL4A5基因新突变。45例曾被误诊其他疾病,其中41例接受过激素和/或免疫抑制剂治疗。结论儿童AS临床表现缺乏特异性,特征性GBM电镜改变仅见于部分患儿,本区域儿童AS误诊误治率仍较高。COL4A5基因新突变比例较高。

WT1基因变异相关肾脏病临床、病理特点与基因变异类型的临床研究

目的探讨WT1变异相关肾病临床、病理特点与基因变异类型的关系。方法回顾性分析2009年1月—2018年5月南方医科大学南方医院、中山大学孙逸仙纪念医院、中山大学附属第一医院儿科新诊治及既往诊治的WT1变异相关肾脏病患儿的临床和病理特点，与WT1基因变异的相关性。结果共诊治WT1变异相关肾脏病患儿20例（新诊治5例），男6例，女14例。（1）Denys-Drash综合征10例：发现蛋白尿的中位年龄为1岁7月龄。弥漫系膜硬化3例，微小病变4例，局灶节段肾小球硬化（FSGS）1例，2例无病理。2例见肾小球基底膜（GBM）显著弥漫增厚。钙神经素抑制剂（CNIs）治疗5例，3例完全缓解，2例部分缓解。8例肾功能仍正常。基因检查结果WT1错义变异6例，无义变异3例，移码变异1例。（2）Frasier综合征（FS）2例：发现蛋白尿的年龄分别为1岁1月龄和1岁9月龄；均为FSGS，GBM分层。分别在1岁6月龄和6岁6月龄进入终末期肾脏病（ESRD）。CNIs治疗1例，蛋白尿部分缓解。均为WT1基因剪切变异。（3）孤立性肾病8例：3例为剪切变异，其中1例5月龄发病已进入ESRD，FSGS 1例，微小病变1例，均见GBM分层；CNIs治疗，1例部分缓解，肾功能正常，1例无效，6岁9月龄进入ESRD。5例为错义变异；3例病理为弥漫系膜硬化的患儿，2例在6月龄即进入ESRD，1例9岁进入ESRD。结论Denys-Drash综合征病情进展慢。WT1基因变异相关肾病基因变异类型中错义变异为11/20，剪切变异为5/20，其中剪切变异相关肾病起病早、进展快，可见GBM分层。CNIs治疗有效降低尿蛋白（8/9）。

六个Lowe综合征家系七例患儿的临床特征与OCRL1基因突变

目的探讨Lowe综合征临床特征、OCRL1基因突变及其与临床表型的关系。方法收集2009年1月至2019年1月就诊于南方医科大学南方医院(4例)和中山大学附属第一医院(3例)Lowe综合征患儿临床资料和外周血标本,提取基因组DNA进行OCRL1基因突变检测。总结分析患儿临床表现特征及OCRL1基因突变与临床表型的关系。结果共收集6个家系7例Lowe综合征患儿临床资料,7例患儿均有眼⁃脑⁃肾表现。其中5个家系6例患儿有先天性白内障和出生时肌张力减低,4例患儿伴眼球震颤,2例有先天性青光眼;另1个家系1例患儿无白内障,仅表现为晶状体变薄。6个家系患儿均有智力运动发育迟缓;有低分子量蛋白尿等近端肾小管功能障碍症状;血清肌酶(AST、LDH、CK、CK⁃MB)升高。6例患儿检测到OCRL1突变,分别位于第10、13、16、18、22、23外显子,其中3个为新突变(c.891G>T、c.1682_1683insAA、c.2564_2567del)。结论本组病例OCRL1新突变比例较高,临床表现存在异质性。第10号外显子突变的患儿临床表现较轻,可无先天性白内障,临床罕见。

敲低NPHP1表达诱导犬肾集合管上皮细胞发生上皮间质转分化

目的研究敲低NPHP1基因表达对。肾小管上皮细胞特性的影响。方法靶向siRNA干扰技术敲低犬肾集合管上皮细胞（MDCK细胞）NPHP1的表达。实验分为空白对照组、阴性对照组、siRNA干扰组。显微镜下观察细胞形态和迁移能力；实时定量PCR和明胶酶谱法分别检测基质金属蛋白酶2和9（MMP2、MMP9）的mRNA表达和酶活性；实时定量PCR、Western印迹和细胞免疫荧光检测上皮钙黏素（E-cadherin）、β联蛋白（β-catenin）、闭锁小带蛋白1（ZO-1）、ZO-1相关核酸结合蛋白（ZONAB）及成纤维细胞标志蛋白仅平滑肌肌动蛋白（仪．SMA）的表达和分布。结果与对照组比较，靶向siRNA干扰24h，MDCK细胞迁移能力增强，E-cadherin、β-catenin、ZO-1的mRNA表达下降（均P〈0．01），α-SMA、MMP2、MMP9及ZONAB的mRNA表达均升高（均P〈0．05）；干扰48h见细胞变梭长形，E-cadherin、B-catenin、ZO-1的蛋白表达均下降（均P〈0．01），ZONAB、d．SMA蛋白表达升高（均P〈0.05），MMP2、MMP9活性升高（均P〈0．01）；干扰72h，可见细胞膜上β-catenin、E-cadherin表达明显减少，呈现断续改变或完全缺失，部分细胞可见α-SMA表达，ZONAB在细胞质和细胞核显著表达。结论敲低NPHPl表达可诱导MDCK细胞发生上皮间质转分化，激活ZO-1／ZONAB信号通路。这些改变可能与I型肾单位肾痨肾间质纤维化发生有关。

一例无肛门闭锁的Townes-Brocks综合征患儿的SALL1基因变异分析

目的分析1例以肾衰竭、多囊性肾发育不良起病,无肛门闭锁Townes-Brocks综合征患儿的临床特征与基因突变特点,为家系的遗传咨询和产前诊断提供依据。方法抽取患儿及其父母的外周血行全外显子测序及Sanger验证。结果患儿为40天龄的男孩,生后7天因呕吐咖啡色物于当地医院就诊,后以"肾衰竭"转入本院。检查发现肾衰竭、多囊性肾发育不良、先天性甲状腺功能减退,伴双侧拇指多指、感音神经性听力下降、耳前皮赘。基因检测显示SALL1基因移码突变(c.824delT,p.L275Yfs*10),Sanger测序验证为新发变异。结论患儿确诊为SALL1基因新发变异所致的Townes-Brocks综合征,无肛门闭锁Townes-Brocks综合征临床较罕见,该变异尚未见国内外报道,丰富了SALL1基因的变异谱。