重组人α2b型干扰素的纯化与鉴定

采用超声波裂解菌体 ,硫酸铵沉淀 ,酸化处理 ,再经离子交换层析和单克隆抗体亲合层析 ,使表达产物纯化了 10 2 9倍 ,比活性达 2 .14× 10 8IU/ mg蛋白 ,SDS- PAGE呈单一条带 ,HPL C纯度 >95% ,回收率达 59.1%。表达产物 N端 2 5个氨基酸序列分析结果与 IFN- α2 b c DNA推导的序列相符合。

大肠杆菌表达的乙型肝炎表面抗原124aa分子的纯化和免疫学鉴定

目的 探索大肠杆菌表达的乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 12 4aa分子作为疫苗成分应用的可能性。方法 以超声破碎法获取包涵体 ,用HisTrapTM试剂盒亲和层析纯化目的蛋白 ,加入聚乙二醇 (PEG40 0 0 )以提高变性蛋白的复性效率 ;以抗HBsAga抗原决定簇单克隆抗体 (McAb)和抗HBsAg多克隆抗体 (PcAb)作为包被抗体 ,采用夹心ELISA法分析其抗原性 ;以纯化产物免疫BALB/c小鼠 ,RIA法测定小鼠血清中抗HBs抗体。结果 通过HisTrapTM 试剂盒亲和层析纯化的HBsAg12 4aa分子经反相高效液相色谱 (RP HPLC)分析 ,纯度达 95 %以上 ;经复性后的蛋白具有抗原性和免疫原性。结论 HBsAg12 4aa分子在大肠杆菌中的成功表达 。

IgM类抗HCV独特型抗体(抗HCV-Ab2)的ELISA法检测及意义

用抗人μ链单克隆抗体建立的ＥＬＩＳＡ法检测１５２例肝病患者ＩｇＭ类抗ＨＣＶ独特型抗体，甲肝阳性率０％（０／１５），乙肝８．５％（４／４７），丙肝３２．１％（２６／８１），丙肝合并乙肝者２２．２％（２／９）。丙肝组内频率为急肝０％（０／１７），慢性迁延性肝炎３８．１％（８／２１），慢性活动性肝炎４３．８％（１４／３２），肝炎肝硬化３６．４％（４／１１）。本法重复性好，批内变异系数４．６％，批间变异系数８．５％。用纯化人抗ＨＣＶ抗体进行阻断，阻断率＞８５％，丙肝组与乙肝组有显著性差异（Ｐ＜０．０１），与各种自身免疫性疾病无交叉，有较好的特异性和精密度，且与血清中ＩｇＭ抗ＨＣＶ关系密切，提示丙型肝炎ＩｇＭ类抗ＨＣＶ－Ａｂ２具有模拟抗原的作用，是慢性丙型肝炎的重要检测指标并与丙肝慢性化有关。

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O15 7∶H7的多重PCR方法 ,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响。方法 选择O15 7∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的 4对引物 ,分别或共同进行PCR扩增 ,检测 4 0株O15 7∶H7和非O15 7∶H7菌株 ,将细菌按 10 1～ 10 6稀释后比较PCR的检测灵敏度。结果 所有O15 7∶H7菌株均在 4 97bp和 6 2 5bp处出现O15 7抗原基因和H7抗原基因产物 ,其产毒株在4 84bp和 (或 ) 2 10bp处出现SLT2和 (或 )SLT1基因产物 ,非O15 7∶H7菌株PCR结果均为阴性 ;单一PCR检测灵敏度为 15 0CFU/PCR反应 ,多重PCR为 >15 0 0CFU/PCR反应。结论 在经过增菌后 ,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便 ,为产毒和非产毒O15 7∶H7的诊断提供了新的手段。

金属硫蛋白在心肌细胞保护中与抗氧化酶的关系

目的 :探讨金属硫蛋白 (MT)在心肌细胞缺氧 /复氧损伤 (H/R)和预缺氧 (HPC)保护中与抗氧化酶的关系。方法 :建立培养的乳鼠心肌细胞缺氧 /复氧模型 ,检测HPC、锌诱导、外源MT和MT抗体等处理下 ,心肌细胞MT含量变化及抗氧化酶 (SOD ,CAT ,GSHpx)活力的相应变化。 结果 :HPC和锌诱导组MT含量及抗氧化酶的活力均显著高于H/R组P <0 .0 5、P <0 .0 1) :外源MT处理后SOD活力显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,CAT和GSHpx活力虽然显著低于对照组但显著高于H/R组 (P <0 .0 1) ;使用MT抗体后 ,酶活力最低。结论 :MT参与HPC的心肌细胞保护作用 。

金属硫蛋白对急性镉中毒后抗氧化酶的保护作用

目的：探讨金属硫蛋白（ＭＴ）对抗氧化酶的保护作用机制。方法：向大鼠尾静脉注射氯化镉建立镉中毒模型，分别于注射后不同时间测定肝组织ＭＴ的含量和抗氧化酶（ＳＯＤ，ＣＡＴ，ＧＳＨｐｘ）的活力变化。结果：镉中毒后３０ｍｉｎ～３ｈ，ＳＯＤ、ＧＳＨｐｘ和ＣＡＴ活力显著降低（Ｐ＜００５），６ｈ酶活力逐步恢复；ＭＴ的显著增加出现在３ｈ，６ｈ达最高峰（１３１９５±１５１５）μｇ／ｇ肝组织，随着ＭＴ的合成增加，抗氧化酶的活力逐步恢复。结论：镉中毒严重抑制抗氧化酶的活力，ＭＴ对抗氧化酶的活力恢复可能有良好的促进作用。

检测霍乱弧菌的基因芯片的制备

目的 研制快速、特异、灵敏的检测霍乱弧菌基因芯片。方法 选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因 ,设计引物和探针 ,并制备检测芯片 ,通过 2次PCR扩增 ,制备荧光标记的靶序列 ,并与芯片进行杂交 ,检测霍乱弧菌和非霍乱弧菌病原体。结果 所有霍乱弧菌菌株在采用单一和多重PCR2种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交 ,均在芯片相应探针处出现阳性信号 ,非霍乱弧菌菌株杂交结果均为阴性。结论 霍乱弧菌基因检测芯片的研制 ,为霍乱弧菌感染的诊断提供了准确、快速、灵敏的方法 ,还可选择更多的基因位点设计探针以提高检测的可靠性 ,可以达到高通量、集成化和自动化的要求。

镉中毒肝脏过氧化氢(H_2O_2)定位及抗氧化系统的变化

为探讨急性镉中毒后自由基产生和损伤的部位及机理，给予大鼠尾静脉注射氯化镉建立急性镉中毒模型，电镜观察自由基过氧化氢（Ｈ２Ｏ２） 的定位及细胞损伤，并测定抗氧化酶和氧化剂的变化。结果表明：Ｈ２Ｏ２ － ＣｅＣｌ３ 的阳性颗粒沉积在肝细胞膜上，最早出现在中毒后１ｈ，３ｈ 最严重，２４ｈ 消失；抗氧化酶活力受抑，以３ｈ 最严重（ｐ＜ ０－０１） ，６ｈ 后渐渐恢复；而ＧＳＨ 的含量在３ｈ 前均高于正常（ｐ ＜ ０－０５），以后逐步减少。提示自由基是急性镉中毒所致肝脏损伤的重要因素。

金属硫蛋白在培养乳鼠心肌细胞缺氧预处理中的作用

目的：探讨金属硫蛋白（ＭＴ）在培养乳鼠心肌细胞缺氧预处理中的作用机制。方法：建立培养的乳鼠心肌细胞缺氧／复氧模型，检测心肌细胞预缺氧２４ｈ后ＭＴ及丙二醛（ＭＤＡ）含量，Ｎａ＋－Ｋ＋ＡＴＰ酶、Ｃａ２＋－Ｍｇ２＋ＡＴＰ酶活性的变化以及用ＭＴ抗体阻断后的相应变化。结果：缺氧预处理组ＭＴ含量及Ｎａ＋－Ｋ＋ＡＴＰ酶、Ｃａ２＋－Ｍｇ２＋ＡＴＰ酶活性显著高于对照组及缺氧／复氧组（Ｐ＜０．０５），ＭＤＡ含量显著低于缺氧／复氧组（Ｐ＜０．０１）；使用ＭＴ抗体后，酶活性则显著降低，而ＭＤＡ含量显著高于未加抗体和对照组（Ｐ＜０．０１）。结论：缺氧预处理产生大量 ＭＴ，后者可能通过减少 ＭＤＡ及促进 Ｎａ＋－ Ｋ＋ ＡＴＰ酶、Ｃａ２＋－ Ｍｇ２＋ ＡＴＰ酶的活性升高起到保护心肌的作用。

乙型肝炎表面抗原124aa分子在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应特异性扩增编码乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）羧基末端１２４个氨基酸的基因片段，并将其在大肠杆菌中获得了高效表达。表达产物氨基末端有１个含６组氨酸肽段的２０氨基酸融合部分，分子量１６１７８Ｄａ，以包含体形式存在，约占细菌总蛋白的２２％。以ＨｉＴｒａｐ亲和层析纯化，纯度可达９５％以上。分别用抗ＨＢｓＡｇ多克隆抗体和抗ＨＢｓＡｇａ单克隆抗体进行ＥＬＩＳＡ检测表明，该蛋白具有ＨＢｓＡｇ反应原性。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌的多重PCR检测

目的 建立同时检测肠出血性大肠杆菌 (O15 7∶H7)和霍乱弧菌的多重PCR方法 ,为霍乱和肠出血性大肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。方法 首先选择O15 7∶H7的O抗原(rfbE)、H鞭毛抗原 (fliC)基因以及霍乱弧菌外膜蛋白 (ompW )和肠毒素A亚单位 (ctxA)基因特异的 4对引物 ,分别或共同对O15 7∶H7和霍乱弧菌进行PCR扩增 ,并以琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果 所有O15 7∶H7菌株均在 4 97bp和 6 2 5bp处出现O15 7rfbE基因和H7fliC基因扩增产物 ;霍乱菌株均出现 5 6 0bp、30 2bp的ompW和ctxA基因扩增产物 ,O15 7∶H7和霍乱弧菌共同扩增可出现 4条单一条带。结论 选择 4对特异引物的多重PCR方法可简便、特异、快速、灵敏地对O15 7∶H7和霍乱弧菌进行同时检测。

人α_1－干扰素基因真核表达载体的构建及其活性

选用与ＨｕＩＦＮ－α１基因及其信号肽相应的引物，采用ＰＣＲ技术，从中国人血白细胞染色体中分离带有信号肽ＩＦＮ－α１基因片段，分别克隆到质粒Ｍ１３ｍｐ１９和Ｍ１３ｍｐ１８中，通过序列分析进行鉴定，然后克隆到家蚕多角体病毒（１３０ｍｂｙｘｍｏｒｉＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）载体ＰＢＦ５的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ之间，用合成的相应寡核苷酸片段为引物进行双链测序，鉴定为阳性重组转移载体后，将其ＤＮＡ和ＢｍＮＰＶ基因组ＤＮＡ共转染家蚕细胞，筛选出重组病毒，再将其感染家蚕细胞，测得细胞培养上清中ＩＦＮ活性为１．０×１０６ＩＵ／ｍｌ。

19例甲型肝炎病人血清和粪便中甲型肝炎病毒感染标记的动态检测

目的 对同一批甲型肝炎病人的各感染标记进行对比研究。方法 采用IF法检测白细胞HAAg,ELISA检测粪中HAAg、血清中的抗-HAV-IgM、抗-HAV,对同一批甲型肝炎病人进行白细胞HAAg、粪HAAg、血清抗-HAV-IgM、血清抗-HAV等各感染标记进行检测。结果 (1)甲肝病人外周血白细胞中有HAAg存在,HAAg的阳性率高于同期粪便中HAAg的阳性率;(2)甲肝抗-HAV-IgM产生较早,抗体滴度升高快,在体内维持时间短。结论 检测血清抗-HAV-IgM是甲肝早期诊断的有效方法之一;IF检测白细胞HAAg是甲肝感染的直接证据,可作为早期诊断方法之一。

牛嗜肝DNA病毒的研究——利用RIA和ELISA在牛奶中检出HBsAg相关抗原

分别利用人乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）放射免疫测定（ＲＩＡ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对某奶牛场４０份牛奶样本进行了测定，结果在样本低稀释时有５份呈现阳性或可疑。肯定了我国牛群中存在新的嗜肝ＤＮＡ病毒种。牛奶中的ＨＢｓＡｇ相关性抗原与人ＨＢｓＡｇ的交叉反应性较低，这同其它哺乳动物嗜肝ＤＮＡ病毒与人乙型肝炎病毒的低同源性相一致。

人胰岛素原类似物(BKRA)基因三联体的构建与表达

将人胰岛素原类似物（ＢＫＲＡ）基因通过人工接头串联，形成基因三联体，接头部分的氨基酸序列为ＲＲＮＳＭ。该串联基因与表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）重组后，实现了在大肠杆菌中的高效融合表达，表达产物以包涵体形式存在，约占细菌总蛋白的３１％。以ＨｉＴｒａｐ凝胶进行亲和层析初步纯化，纯度可达９３％。放射免疫测定表明，纯化的融合蛋白具有胰岛素抗原活性，为进一步生产基因工程胰岛素打下了基础。

重组病毒－家蚕细胞系统表达人α_1－干扰素的纯化研究

用重组家蚕核多角体病毒（ｒＢｍＮＰＶ－ＩＦＮ－α）感染家蚕细胞，经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析柱及单克隆抗体亲和层析，从细胞培养液中分离纯化α－干扰素，纯化倍数为１０１０，比活性为５．８７×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电冰呈单一条带，并用激光解离电离飞行质谱分析测定其分子量为２０４６５Ｄ，毛细管电泳鉴定纯度为９９．１％。表达产物Ｎ端１５个氨基酸分析结果与ＩＦＮ－α１ｃＤＮＡ推导的序列相同。