基于微小RNA-信使RNA互作在畸形精子症中的潜在发生机制研究

目的探讨微小RNA(miRNA)-信使RNA(mRNA)互作在畸形精子症中的潜在作用及机制。方法选取2018年1—12月于江西省妇幼保健院就诊的30例畸精症患者作为观察组,另选取同期于江西省妇幼保健院工作的30名正常男性作为对照组。构建mRNA和miRNA基因表达谱,并通过京都基因和基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)富集分析后进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进一步验证。结果通过miRNA测序研究畸精症中miRNA的影响,共发现23个差异表达miRNA,同时满足log2FC|>0.585和P<0.05。23个差异表达miRNA的表达,有17个上调miRNA来自9个miRNA家族和6个下调的miRNA来自5个miRNA家族。使用KEGG和GO分析差异表达miRNA的2022个差异表达靶mRNA,共获得10条通路和9个注释簇。10条通路包括果糖和甘露糖代谢、磷酸戊糖通路、酵解/糖异生、碳代谢、氨基酸生物合成、核因子κB(NF-κB)信号通路、信号转导子和转录激活子(STATs)、丝裂原激活蛋白激酶(MAP)信号通路、Th1和Th2细胞分化、Toll样受体信号通路。注释簇1总结了3个GO术语;注释簇2总结了41个GO术语;注释簇3总结了3个GO术语;注释簇4总结了3个GO术语;注释簇5总结了3个GO术语;注释簇6总结了3个GO术语;注释集群7总结了38个GO术语;注释簇8总结了4个GO术语;注释簇9总结了10个GO术语。使用RT-PCR检测注释簇9中的3个miRNA和8个mRNA。miR-375-4-3p是上调的miRNA,而miR-31-12-5p和miR-9-6-5p是下调的miRNA。在4个GO术语中检测NF-κB、环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E合酶(PTGES)和基质金属蛋白酶9(MMP9)表达。在3个GO术语中检测白细胞介素(IL)-11、Spi-B转录因子(SPI1)、T细胞中表达的T-box转录因子(T-Bet)和IL-4/13A表达。RT-PCR的结果与miRNA和mRNA测序的结果一致,观察组miR-375-4-3p、NF-κB、COX-2、PTGES和IL-4/13A mRNA表达高于对照组,而miR-31-12-5p、miR-9-6-5p、MMP9、IL-11、SPI1和T-Bet mRNA表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论畸精症中有23个差异表达的miRNA和2022个目标mRNAs,可使用KEGG和GO富集分析获得5条通路和7个目标mRNA炎症免疫抑制损伤相关的GO术语,miRNAs可通过miRNA-mRNA网络分析介导炎症免疫抑制损伤相关机制参与畸精症进展,但具体机制需进一步研究。

组织芯片技术检测人睾丸基因TDRG1在睾丸肿瘤组织中的表达

目的:探讨人睾丸基因TDRG1在睾丸肿瘤组织中的蛋白表达及其病理学意义。方法:运用组织芯片技术、免疫组化法检测人睾丸特异基因TDRG1在睾丸肿瘤组织和正常睾丸组织中的表达。结果:15例正常人睾丸对照组中11例(73.3%)TDRG1蛋白表达为阳性;26例精原细胞瘤中7例(26.9%)TDRG1蛋白表达为阳性,7例畸胎瘤中4例(57.1%)TDRG1蛋白表达为阳性。而12例胚胎癌中10例(83.3%)TDRG1蛋白表达为阳性,10例卵黄囊瘤中8例(80.0%)TDRG1蛋白表达为阳性。精原细胞瘤实验组与正常人睾丸对照组相比较,两组间具有极显著性差异(P<0.01)。畸胎瘤实验组与正常人睾丸对照组相比较,两组间具有显著性差异(P<0.05)。而胚胎癌组和卵黄囊瘤组与正常人睾丸对照组相比较,没有显著性差异(P>0.05)。结论:TDRG1蛋白在精原细胞瘤和畸胎瘤的表达水平较正常对照睾丸组织显著降低,TDRG1可能为候选的抑癌基因。

有精子且已生育的克氏综合征(非嵌合体)1例报告

克莱恩费尔特综合征(Klinefelter syndrome,KS),简称克氏综合征,是于1942年由Klinefelter等[1]最早提出的一种最为常见的性染色体畸变疾病,主要分为嵌合型和非嵌合型两类,嵌合型KS一般能在精液中找到精子,而80%[2]为47,XXY非嵌合型患者极少有精子。非嵌合型KS有精子且自然生育报道极为罕见。本文就1例非嵌合体克氏综合征患者有精子且已生育进行详细介绍。1临床资料患者,男,31岁。因妻子产后未避孕未育7年就诊于我院辅助生殖中心男科。现病史:结婚7年,有正常规律性生活,7年前妻子自然受孕生育1女(健存,我院检查染色体核型正常),后一直未避孕未育。既往体健。否认生殖相关疾病史。

47,XYY/46,XY嵌合体患者2例

1病例报告1.1病案1患者,李某,男,29岁,以“结婚同居未避孕未育2年”。父母非近亲结婚,家中有同胞弟弟1人(已生育1女,健康)。患者性欲可,勃起正常,每周性生活2~3次,每次持续时间约4~6min。查体:神清合作,身高165cm,体重51kg,发育良好,性格内向,孤僻寡语,智力正常,无暴力行为,耳位及大小均正常,无漏斗胸,无翼状肩。男科专科检查:阴毛呈男性型分布,阴茎发育可,左右侧睾丸大小各约为8ml和4ml,双侧附睾可及,质中,双侧输精管可及,双侧精索静脉未触及曲张。辅助检查:我院精液分析(按照WH0第五版)结果示:3次均为少弱精子症,(其中2016年11月25日报告:精液量:1ml,精子浓度2百万/ml,精子活力15%,前向运动精子率10%;2017年9月28日报告:精液量:1ml,精子浓度2百万/ml,精子活力10%,前向运动精子率8%)。精子正常形态率检查正常。

穿膜肽-TDRGl重组蛋白原核表达载体的构建

构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体。以p YD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段。同时利用内切酶对已构建好的载体pET28aTAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证。PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致。成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT。

人睾丸特异表达基因TDRG1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体(mAb)。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。结果:成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论:所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。

126例梗阻性无精子症借助ICSI治疗的临床结局分析

目的探讨梗阻性无精子症采用不同方式获取的精子对卵胞浆内单精子注射术(ICSI)治疗的妊娠结局。方法根据获取精子的方式不同将梗阻性无精子症患者分为两组:TESA组46例、PESA组80例,两组患者均行ICSI治疗。比较两组受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率及临床妊娠率等。结果 TESA组与PESA组的卵裂率分别为88.2%和94.2%,优质胚胎率分别为62.2%和62.5%,两组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。两组受精率分别为72.1%和77.6%,种植率分别为23.3%、34.8%,临床妊娠率分别43.1%、68.7%,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PESA或TESA结合ICSI是治疗梗阻性无精子症的有效治疗方法 ,附睾精子优于睾丸精子,可首选抽取附睾精子。

应用实时硬度监测结合多普勒超声诊断勃起功能障碍

目的:探讨前列腺素E1(PGE1)阴茎海绵体注射后实时阴茎硬度检查仪(Rigiscan)结合多普勒超声技术诊断勃起功能障碍(ED)的价值。方法:1998年1月至2007年12月间的1392例ED患者,使用PGE1阴茎海绵体注射,Rigiscan连续记录1h,观察阴茎勃起情况。使用阴茎彩色超声诊断仪检测阴茎海绵体阴茎深动脉,测量血流参数。结果:1392例患者中阳性反应者1039例,阴性反应者353例。阳性反应者中,PGE1注射剂量为10μg663例,20μg265例,30μg97例,60μg14例,分别检出血管功能障碍89(13.4%)、39(14.7%)、41(42.3%)及10(71.4%)例。Rigiscan检查阴性者血管性ED267例(75.6%)。不同剂量PGE1激发勃起与血管功能障碍比率比较有统计学意义(P<0.001)。结论:前列腺素E1诱导阴茎勃起安全有效。药物激发勃起时,所需药物剂量越大,血管功能障碍的检测率越高。实时硬度监测结合多普勒超声检查能提高血管性ED的诊断准确率。

人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达

目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486,TDRG1-shRNA738,TDRG1-shRNA921和一个阴性对照,使用Lipofectamine 2000转染shRNA至NTERA-2细胞,应用RT-PCR法检测转染后NTERA-2细胞TDRG1 mRNA的表达水平。结果:经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486的NTERA-2细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1的shRNA表达载体,TDRG1-shRNA在NTERA-2细胞内成功表达。

特发性低促性腺激素型性腺功能减退2例报告

特发性低促性腺激素型性腺功能减退症（IHH）是指病因不明的下丘脑或垂体病变引起促性腺激素释放激素（GnRH）或促性腺激素的缺乏,不能刺激靶性腺发育而导致第二性征发率异常。1临床资料例1,男,24岁,高中。因婚居未避孕未育1＋年来我院诊治。患者声音细,外生殖器小于同龄男性。既往体健,系足月平产,母乳喂养;父母非近亲结婚,无家族遗传病史。入院体格检查：

玻璃化冷冻和慢速冷冻对微量精子活动率的影响

目的探讨玻璃化冷冻和慢速冷冻对微量精子活动率的影响。方法收集50份正常精液样本经密度梯度离心和上游法处理后,分别行玻璃化冷冻和慢速冷冻。比较冷冻前,玻璃化冷冻复苏后以及慢速冷冻复苏后精子活动率的变化,评估玻璃化冷冻和慢速冷冻两种方法的复苏效果。结果冷冻前精子活动率为92.94%±3.72%,玻璃化冷冻复苏组精子活动率为63.46%±5.25%,慢速冷冻复苏组精子活动率为62.86%±5.51%。玻璃化冷冻复苏组和慢速冷冻复苏组的精子活动率与冷冻前比较,均出现显著性降低,差异有统计学意义(P<0.001)。但玻璃化冷冻复苏组和慢速冷冻复苏组复苏后的精子活动率对比分析无统计学差异(P>0.05)。结论玻璃化冷冻和慢速冷冻均可导致精子活动率的下降,但两种冷冻方法复苏结果之间无统计学差异。

穿膜肽EGFP的构建及其对人成熟精子的穿膜活性鉴定

目的：构建穿膜肽TAT与EGFP融合蛋白的原核表达系统，研究该融合蛋白对人成熟精子的穿膜作用和对精子运动参数的影响。方法以pEGFP-N1载体为模板，设计N端和C端含有TAT序列的引物，用PCR技术扩增TAT-EGFP和EGFP-TAT基因，扩增产物插入载体 pET28a，构建成重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT。将重组质粒转入大肠杆菌DE3中，IPTG诱导TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后SDS-PAGE电泳鉴定。将融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分别加入正常人精子中孵育，荧光显微镜观察融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT穿膜情况。结果成功构建了高表达重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT，纯化了分子质量约为32 kD的融合蛋白 TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在正常人成熟精子中有穿膜作用。不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT对正常人成熟精子存活率及运动参数无明显影响。结论通过对融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT表达纯化及活性分析，证实穿膜肽TAT在精子中的跨膜转运作用，为将来精子研究提供了实验基础。

SMART技术构建恒河猴睾丸组织全长cDNA文库

目的运用SMART技术构建恒河猴睾丸组织全长cDNA文库。方法提取恒河猴睾丸组织总RNA并分离出mRNA,用clontech公司SMART^(TM)cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得全长cDNA双链;经SfiI酶切、层析柱分离后,500bp以上的片段与pDNR-LIB连接后电转化及铺板,建成原始文库。结果经鉴定,原始文库为2.5×10~6个重组子,扩增后文库滴度为4.5×10~9CFU/mL。重组率为100%,平均插入片段为1.6kb。结论已构建文库质量较高,为进一步筛选、克隆睾丸特异表达基因奠定了基础。

腺苷及其受体在男性泌尿生殖系统的研究进展

早在1929年，Drury等就已发现腺苷对心脏的作用，但直到1972年Bumstock才提出嘌呤能假说。目前研究表明，腺苷信号通路参与了体内多方面生理与病理过程。本文就腺苷及其受体在泌尿生殖系统的表达及作用机制作一综述。

麒麟丸治疗少弱精子症的系统评价

男性不育症是21世纪影响人类健康的主要问题之一，其发病率占已婚夫妇的15%，其中男方因素约占50%[1]。少弱精子症是男性不育常见的病因之一，针对少弱精子症治疗，中医药具有较明显的优势[2]，但有明确疗效的药物仍不多见。麒麟丸是由制首乌、菟丝子、枸杞子、覆盆子、淫羊霍等中药组方研制而成，是在朱丹溪“五子衍宗丸”基础上承继传统中医药学“肾主生殖”理论研制成的治疗男性不育的一种中成药[3]。至今国内外尚无公开发表有关麒麟丸（国药准字z10930034，生产厂家：广东太安堂药业股份有限公司）治疗少弱精子症的Meta分析。为此，本研究旨在搜集当前全世界范围内使用麒麟丸治疗少弱精子症的随机对照试验（randomized controlled trial，RCT），客观评价联合治疗疗效与安全性，以期为其临床应用提供更可靠的证据。

人类睾丸基因TDRG1在不同物种间同源序列的克隆及分析

目的克隆人类睾丸特异基因TDRG1在不同物种间的同源序列,为研究该基因功能寻找动物模型。方法以人TDRG1基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN软件检索小鼠、大鼠、黑猩猩和猕猴基因组数据库,查询到的同源序列运用RT-PCR实验验证。免疫组化染色初探TDRG1同源蛋白在不同物种间的表达。结果生物信息学分析表明小鼠和大鼠基因组中未检索到与TDRG1同源的序列,黑猩猩和猕猴基因组中分别有相似性为98%和90%的同源序列存在。RT-PCR验证了猕猴睾丸中的同源序列,免疫组化结果显示抗人TDRG1单克隆抗体能特异结合猕猴睾丸中的同源蛋白。RT-PCR和免疫组化染色也表明小鼠和大鼠睾丸中无同源序列和同源蛋白表达。结论 TDRG1基因在小鼠和大鼠睾丸中无同源基因表达,而在猕猴和黑猩猩睾丸中有同源基因表达,为今后建立动物模型提供了理论依据。

人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达。方法取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的蛋白质的表达。结果 RT-PCR扩增出TDRG1基因编码序列,目的插入片段长约303bp;产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功;该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39.8kD的目的蛋白表达。结论成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达。

Clusterin蛋白在男性不育症睾丸组织中的表达及意义

目的探讨Clusterin蛋白在男性不育症患者睾丸组织中的表达及意义。方法采用免疫组化染色法和Western blot法检测了10例正常睾丸组织,8例梗阻性不育患者睾丸组织,13例非梗阻性不育患者睾丸组织标本中Clusterin蛋白的表达水平。结果免疫组化染色结果表明,3组睾丸组织中C1usterin蛋白都有表达,正常睾丸组织、梗阻性不育患者睾丸组织、非梗阻性不育患者睾丸组织中阳性或强阳性表达率分别为100%(10/10),87.5%(7/8),46%(6/13),非梗阻性不育睾丸组织中Clusterin蛋白表达水平显著低于正常睾丸组织(P<0.05)。Western blot法检测结果也表明,该蛋白在非梗阻性不育睾丸组织中的表达较正常睾丸组织显著降低,而在梗阻性不育睾丸组织中的表达无显著性降低。结论 Clusterin蛋白的表达降低与非梗阻性不育症的发生密切相关。

腺苷及其受体在生殖系统的研究进展

腺苷是一种内生性核苷,由腺嘌呤和核酸糖组成,广泛分布于哺乳动物各个组织中。细胞内的前体腺嘌呤核苷酸如三磷酸腺苷(adenosine 5'-triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine 5'-diphosphate,ADP)和单磷酸腺苷(adenosine 5'-monophosphate,AMP)等经核苷磷酸水解酶和5'-外核苷酸酶水解为腺苷,并经腺苷转运载体分泌于胞外,腺苷及其受体在体内发挥着至关重要的作用,如在神经系统和呼吸系统中等。在生殖系统中腺苷及其受体与阴茎勃起功能和精子活力有关;调节睾丸细胞分泌;在输精管中发挥神经样调节作用;调节附睾和前列腺平滑肌收缩;参与调节卵巢细胞内分泌和卵母细胞成熟;调节输卵管细毛运动和子宫平滑肌舒缩;调节胎盘血流量等。本文就腺苷及其受体在生殖系统的表达及作用作一综述。