不同营养支持途径对外科创伤应激后相关肠黏膜形态和屏障功能影响的实验研究

目的探讨肠外和肠内营养对外科创伤应激大鼠肠上皮细胞紧密连接、屏障功能及微生态环境的影响。方法SD大鼠随机分成对照组、全肠外营养组(TPN)和普通肠内营养组(EN)。建立创伤应激模型,接受等氮、等能量营养支持后光镜和电镜下观察肠黏膜形态,比较肠道细菌脏器移位率、肠黏膜occludin蛋白免疫组化表达及肠道菌群数量等。结果电镜下TPN组肠上皮损伤程度较严重,而EN组损伤程度较轻,肠上皮紧密连接、微绒毛较完整;光镜下Chiu分级,TPN组和EN组比较差异有统计学意义(P<0.05)。EN组肠道跨膜结合蛋白表达优于TPN组(P<0.05)。EN组肝、肺和肠系膜淋巴结的肠道细菌移位率低于TPN组(P<0.05)。EN组肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌数量均高于TPN组,但差异未达到统计学意义。结论肠内及标准肠外营养都不能完全维持创伤大鼠肠黏膜屏障不受损害及阻止肠道细菌移位,但肠内营养组肠黏膜屏障损害较轻,肠道细菌移位率低,且增加了肠上皮occludin蛋白表达,与肠外营养比较,有利于改善肠道屏障,从而减少细菌移位的可能。

ErbB信号与蛋白激酶B在快速起搏所致猴心衰心肌细胞损伤中的作用

为了研究ErbB受体与蛋白激酶B在心力衰竭发生机制中的作用,建立快速起搏诱导恒河猴心力衰竭模型。采用颈总动脉插管技术,测定左心室最大压力上升速度(LVdp/dtmax)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室收缩末期压(LVSP)等血流动力学指标;采用电化学发光免疫测定法观察脑钠肽(BNP)含量;采用RT-PCR方法测定ErbB2、蛋白激酶B(PKB)、Bcl-xl mRNA表达水平;采用Western blotting检测蛋白激酶B活性(phospho-PKB,即磷酸化蛋白激酶B蛋白水平)及凋亡相关基因Bcl-xl的蛋白水平。快速起搏诱导心力衰竭模型恒河猴心肌收缩能力显著下降,心衰标志物脑钠肽水平明显上升(P<0.05)。与对照组比较ErbB2,PKB及Bcl-xl mRNA表达水平明显下降(P<0.05),同时心肌组织蛋白激酶B活性显著下降,Bcl-xl蛋白水平也明显下降(P<0.05)。快速起搏所致猴心衰心肌细胞损伤的机制可能与ErbB2、下游蛋白激酶B、凋亡抑制基因Bcl-xl表达水平下降及蛋白激酶B活性下降有关。

灰兜巴活性成分治疗Ⅱ型糖尿病效果研究

目的:研究灰兜巴各活性成分对Ⅱ型糖尿病的治疗作用。方法:将从灰兜巴提取所得的活性成分分为蛋白质组、多糖组、生物碱组及复合组(蛋白质、多糖和生物碱联合使用),分别对四氧嘧啶制作的Ⅱ型糖尿病模型小鼠进行治疗,30 d后测定小鼠体质量、血糖、肾脏皮质的醛糖还原酶含量及α-葡萄糖苷酶抑制率。结果:经治疗后,与模型组比较,蛋白质组与复合组的小鼠体质量显著升高,血糖显著降低,多糖组、生物碱组指标变化无显著性;蛋白质组、多糖组、生物碱组及复合组的肾脏醛糖还原酶含量分别为0.940、1.30、1.31和0.772 mU/mL;对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为46.84%、2.31%、0.96%和52.28%。结论:灰兜巴治疗Ⅱ型糖尿病主要有效成分为其蛋白质成分。

血管内皮衰老和氧化应激

内皮活性氧主要来源于线粒体、内皮一氧化氮合成酶和NADPH氧化酶4。过量活性氧是氧化应激的主要原因,也是内皮衰老及相关疾病的主要原因之一。但细胞已经进化出合适的抗氧化信号通路及时清除过量活性氧,如Nrf2/Keap1-ARE、PPARγ、SIRT和FOXO等。其中,Nrf2/Keap1-ARE信号通路是目前已知的最强大内源性抗氧化信号通路。而且,这些通路之间可以协同作用抵抗氧应激损伤并促进细胞存活。对内皮衰老和氧化应激之间的关系理解有助于提供防治氧化应激相关疾病有用信息。

恒河猴(Macaca mulatta)肝脏cDNA文库的构建

目的构建正常恒河猴的肝脏组织cDNA表达文库,以筛选恒河猴的相关基因并提供其作为医学研究动物模型的遗传学依据。方法提取正常恒河猴肝脏组织总RNA,纯化的mRNA反转录合成cDNA,连接EcoR接头,经Xho酶切并用CHROMA SPIN-400分离cDNA,将大于500bp的cDNA片段连接于λZAP表达载体,体外包装后转染至XL1-BlueMRF’宿主菌中,再扩增文库。对cDNA文库的滴度、重组率和插入片段的大小进行检测。结果初始文库的库容量为1.2×106pfu,初始文库和扩增文库的滴度分别为1.1×106pfu/mL、7.7×109pfu/mL,重组率分别为99.3%、98.2%,插入片段平均长度分别为2.0kb、2.3kb。结论成功构建了恒河猴肝脏组织的cDNA表达文库,为同种和异种移植以及移植相关药物临床前研究奠定了良好的基础。

免疫抑制剂依维莫司对大鼠胰岛细胞的毒性作用

目的观察依维莫司等免疫抑制剂对大鼠胰岛瘤细胞(INS-1)和SD大鼠正常胰岛细胞代谢活性和功能的影响,旨在探讨依维莫司在胰岛移植免疫抑制治疗中的安全性和可行性。方法不同浓度梯度免疫抑制剂依维莫司、西罗莫司、环胞霉素A和霉酚酸酯处理INS-1和正常胰岛细胞,用MTT法检测细胞的代谢活性;用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测胰岛细胞的胰岛素分泌功能。结果临床血药浓度以上的依维莫司和西罗莫司高浓度组胰岛细胞增殖抑制率低于环胞霉素A和霉酚酸酯(P<0.05);依维莫司在临床血药浓度范围和其它免疫抑制剂一样可以抑制胰岛细胞的胰岛素分泌功能,各组间的刺激指数差异无统计学意义。结论依维莫司和西罗莫司对INS-1细胞及SD大鼠胰岛的毒性作用较小,环胞霉素A和霉酚酸酯对INS-1和SD大鼠胰岛具有较为明显的毒性作用,依维莫司有望作为新型免疫抑制剂应用于临床胰岛移植。

大鼠骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的负调节作用

[目的]探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的免疫负调节作用。[方法]分离和鉴定大鼠MSCs,用MTS法观察该细胞对淋巴细胞增殖活性的影响,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测MSCs与淋巴母细胞混合培养液24h后上清中LDH活性。[结果]大鼠MSCs表型为CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD95+和SH-2+,具有诱导分化成脂肪和成骨的潜能力,对ConA刺激的淋巴细胞增殖有显著的抑制作用,能够诱导淋巴母细胞裂解,释放LDH。[结论]MSCs能够抑制淋巴细胞的活化增殖,这种负向免疫调节功能有可能在免疫耐受诱中发挥作用。

版纳微型猪近交系外周血淋巴细胞cDNA文库的构建

[目的]构建版纳微型猪近交系(BMI)外周血淋巴细胞中cDNA文库。[方法]取新鲜BMI外周血,分离淋巴细胞,并进行体外诱导培养,提取总RNA,纯化mRNA。按照SMART cDNA library construction kit提供的方法构建BMI外周血淋巴细胞cDNA初始文库,进行滴度测定及文库扩增。[结果]初始文库和扩增文库的滴度分别为1.1×106pfu/ml和2.5×109pfu/ml,重组率分别为98.2%和89.1%,插入片段平均长度大于1200bp。[结论]成功地构建了BMI外周血淋巴细胞cDNA文库。

恒河猴凝血因子VII的体外表达初探

[目的]探索恒河猴凝血因子VII的体外原核蛋白表达方法。[方法]利用已得到的恒河猴凝血因子VII cDNA序列,构建了带有6His表达标签的大肠杆菌原核表达重组质粒pET-DsbA-MCFVII,再转入大肠杆菌中进行诱导表达,并使用SDS-PAGE蛋白质电泳和Western Blot法检测蛋白表达情况。[结果]目的蛋白主要以包涵体形式表达,但是在菌液上清和菌体裂解液中也能检测到可溶形式的目的蛋白。[结论]恒河猴凝血因子VII在大肠杆菌中能够以可溶形式表达。

恶性血液病患者侵袭性真菌感染GM和BG抗原检测的价值

目的 评价半乳甘露聚糖（GM）抗原和（1→3）-β-D葡聚糖（BG）抗原检测对恶性血液病患者侵袭性真菌感染（IFI）的诊断价值以及两种方法在监测抗真菌治疗效果中的作用.方法 51例恶性血液病患者当体温超过38 ℃,持续48 h以上,经广谱抗生素治疗无效,或起初有效但体温下降后再次升高时被纳入本研究.第1周采集患者静脉血2次,以后每周采血1次,至少监测4周.分别采用ELISA法和比色法检测患者血清GM和BG值.GM实验阳性定义为连续两次不同时点检测GM值＞0.5或单次＞0.8,G实验阳性定义为BG值＞80 pg/ml.患者分为确诊、临床诊断、拟诊及非真菌感染四组,21名正常志愿者作为对照.结果 51例患者共收集240份血清标本.其中确诊IFI2例,临床诊断26例,拟诊17例,非真菌感染6例.以确诊及临床诊断为真阳性组,以非真菌感染为真阴性组.GM实验在真阳性组28例中21例阳性,真阴性组6例中1例阳性,敏感性75%,特异性83.3%,阳性预测值95.5%,阴性预测值41.7%;G实验在真阳性组28例中全部阳性,真阴性组6例中4例阳性,敏感性100%,特异性33.3%,阳性预测值87.5%,阴性预测值100%.G实验的敏感性高于GM实验,差异有统计学意义（P=0.015）;但特异性差异无统计学意义（P=0.242）.GM实验阳性的21例患者中抗真菌治疗有效19例,GM值渐转阴性,2例无效的患者GM值持续阳性,有效组GM平均值两周后明显低于无效组,差异有统计学意义（P＜0.05）;G实验阳性的患者中治疗有效者BG值逐渐下降,但未转阴;治疗无效组BG值变化无规律,总体呈上升趋势,但各时间点BG值监测对疗效无明显判断意义.结论 血清GM和BG抗原检测可以为早期诊断IFI提供有力证据,联合检测BG和GM两种抗原,可提高对曲霉菌诊断的特异性,减少假阳性.治疗中监测GM和BG值的动态变化,GM实验用于评价疗效的价值优于G实验.

添加特需营养素的营养支持对手术创伤后肠黏膜形态和屏障功能的影响

目的探讨补充益生菌等特需营养素对手术应激后机体肠道屏障功能、上皮紧密连接及微生态的影响。方法SD大鼠70只随机分成对照组、全肠外营养组（TPN组）、普通肠内营养组（EN组）和生态免疫肠内营养组（EEN组）。建立创伤应激模型，接受等氮、等能量营养支持后光镜和电镜下观察肠黏膜形态和紧密连接，比较肠道细菌脏器易位率、肠道菌群数量及肠黏膜occludin蛋白免疫组织化学表达。结果（1）电镜下观察，TPN组肠上皮损伤程度较严重，而EN组和EEN损伤程度较轻，肠上皮紧密连接、微绒毛较完整；光镜下chiu分级，TPN组和EN及EEN组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。（2）EEN组和EN组肠道跨膜结合蛋白表达明显优于TPN组，且EEN和EN组间差异也有统计学意义（P〈0.05）。（3）EEN组和EN组肝、肺和肠系膜淋巴结的肠道细菌易位率低于TPN组.差异有统计学意义（P〈0.05）。（4）EEN组和EN组肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌数量均高于TPN组，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论联合益生菌、肠道黏膜营养素、免疫营养素的营养支持能明显改善肠道微生态环境，维持肠道黏膜屏障和紧密连接，从而防止肠道菌群易位。

不同剂量氧嗪酸钾联合腺嘌呤诱导大鼠高尿酸肾损伤模型的建立与评价

目的通过不同剂量氧嗪酸钾联合腺嘌呤诱导大鼠高尿酸血症,探索大鼠高尿酸血症模型的最佳条件,为高尿酸血症的治疗研究提供可靠的动物模型。方法将体重220~240 g成年雄性Sprague-Dawley大鼠56只,按照每组8只分为正常对照组及不同剂量氧嗪酸钾(1000、1500 mg/kg)联合腺嘌呤(0、50、100 mg/kg)模型组6个,连续灌胃5周,每周对大鼠进行尾静脉采血,检测血清中血尿酸、血肌酐和血尿素氮水平。6周后取材,观察大鼠肾脏的病理改变,肾组织炎症、纤维化相关因子的mRNA及蛋白表达水平变化。结果1500 mg/kg氧嗪酸钾联合100 mg/kg腺嘌呤组大鼠造模2周后开始死亡,第6周生存率为62.5%;其余各组大鼠生存率与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比,造模1周后,各模型组大鼠血尿酸水平均有显著升高(P<0.05),第6周停止造模后血尿酸基本恢复到造模前水平;各模型组动物血肌酐、血尿素氮水平在第5周均较正常组有所升高;与正常组相比,模型组大鼠肾组织的炎症和纤维化相关因子mRNA和蛋白表达水平均随氧嗪酸钾联合腺嘌呤的剂量增加而增加,其中氧嗪酸钾1000 mg/kg联合腺嘌呤100 mg/kg组及氧嗪酸钾1500mg/kg联合腺嘌呤50 mg/kg组与正常组的差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠肾脏解剖及组织学检测结果显示,模型组随着氧嗪酸钾及腺嘌呤剂量的增加,各组均有不同程度的肾髓质白色沉积,肾小管间质纤维化,小管上皮细胞坏死增加,肾小球萎缩。50 mg/kg腺嘌呤联合1500 mg/kg氧嗪酸钾组大鼠肾组织炎症与纤维化相关基因和蛋白的表达水平相比正常组有所升高,且可见组织炎性细胞浸润和纤维化的发生,符合高尿酸血症所致肾损伤的临床表现。结论氧嗪酸钾(1500 mg/kg)联合腺嘌呤(50 mg/kg)连续灌胃5周能够建立稳定的大鼠高尿酸肾损伤模型。

恒河猴外周血调节性T淋巴细胞的分离纯化及鉴定

目的建立恒河猴外周血CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Tregs)快速有效的分离纯化方法。方法 4～5岁健康恒河猴10只,雌性4只,雄性6只,体重5～8 kg;于大隐静脉抽取外周血,每只抽取8 mL。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),分别采用非人灵长类Tregs分离试剂盒的生物素标记的混合抗体和磁珠标记的抗生物素抗体阴性分选,以及大鼠抗人CD4-活化蛋白C(activatedprotein C,APC)和抗APC多选试剂盒中的磁珠标记的抗APC抗体阳性分选出CD4+T淋巴细胞,比较两种方法获得细胞的得率、活性及纯度;选择得率、活性和纯度较高的分选方法获得的CD4+T淋巴细胞,用磁珠标记的抗人CD25抗体进行阳性分选,获得CD4+CD25+Tregs,流式细胞仪检测纯度、活性及FoxP3表达水平,以及Tregs对刀豆蛋白(concanavalinA,ConA)刺激的自体CD4+CD25-效应性T淋巴细胞(effective T cells,Teffs)增殖的抑制功能。结果 CD4+T淋巴细胞阳性分选和阴性分选后,细胞活性均达95%左右,差异无统计学意义(P>0.05),但阳性分选后CD4+T淋巴细胞得率和纯度均显著高于阴性分选(P<0.05)。后续CD4+CD25+Tregs分选采用阳性分选法获得的CD4+T淋巴细胞。经双阳性分选收集的目的细胞中CD4+CD25+Tregs占76.2%±8.6%,活细胞比例为93.3%±4.7%,FoxP3阳性细胞比例为74.2%±6.9%。混合培养后Tregs均对ConA刺激的Teffs的增殖有抑制作用。结论免疫磁珠双阳性分选法能有效分选出恒河猴外周血中有功能的CD4+CD25+Tregs。

骨髓间充质干细胞对大鼠到小鼠胰岛移植的保护作用

目的探讨同种异基因骨髓间充质干细胞(bone mesenchamal stem cells,BMSC)静脉输注对大鼠到小鼠胰岛移植物的功能保护和小鼠糖尿病状态改善。方法全骨髓培养法获得C57BL/6小鼠BMSC。不连续梯度离心法分离纯化Sprague-Dawley(SD)大鼠胰岛,将300胰岛当量的胰岛单独或与BMSC联合移植入链脲菌素诱导的糖尿病BALB/c小鼠肾包膜下,并通过尾静脉在移植后0、3和5d注射CM-DiI标记的BMSC 5×105/只,对照组给于磷酸盐缓冲溶液。移植后监测血糖,第9天处死小鼠,取肝、脾、胸腺、淋巴结和移植胰岛的肾脏,冰冻切片,荧光显微镜观察CM-DiI标记细胞的组织分布;免疫荧光法观察移植物中胰岛素和胰高血糖素表达,评价胰岛的功能。结果 BMSC静脉输注后主要分布于胸腺,其次是脾脏和淋巴结,肾和肝组织中未观察到BMSC;BMSC联合胰岛移植组血糖控制水平优于其他组,且在第7天的口服糖耐量实验优于单纯胰岛移植组。结论与胰岛联合移植的BMSC对受者免疫器官和组织有明显的趋向性,且对胰岛细胞的体内存活有一定保护作用。

BMSCs对猪胰岛缺氧再给氧损伤的保护作用

目的研究恒河猴BMSCs在缺氧再给氧环境下对新生猪胰岛活性和功能的保护作用。方法取健康成年恒河猴5只,体重6～10 kg,取骨髓采用骨髓单核细胞贴壁培养法筛选获得BMSCs;取3～5日龄新生长白猪5只,取胰腺以Ⅴ型胶原酶消化制备新生猪胰岛。将实验分为胰岛正常组(A组)、胰岛加BMSCs正常组(B组)、胰岛缺氧再给氧组(C组)、胰岛加BMSCs缺氧再给氧组(D组),观察比较常规培养和缺氧(1%O2)12 h再给氧24 h或48 h条件下,胰岛的功能活性变化:二乙酸荧光素/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色计算胰岛成活率;细胞计数试剂盒8法检测新生猪胰岛的代谢活性;膜联蛋白V-FITC/PI标记后流式细胞仪检测胰岛凋亡率;葡萄糖刺激法分析胰岛功能糖刺激指数(stimulation index,SI)。结果 C组较A、B组胰岛团更为分散,死亡细胞增多;D组较C组胰岛团完整,成活率更高。A、B、C、D组胰岛成活率分别为90.2%±9.1%、88.3%±5.9%、52.3%±12.1%、71.4%±11.5%,C、D组显著低于A、B组(P<0.05),D组显著高于C组(P<0.05)。D组BMSCs以1∶10和1∶20比例与胰岛缺氧再给氧共培养后,代谢活性显著高于C组(P<0.05)。A、B、C、D组胰岛凋亡率分别为27.1%±3.2%、24.0%±1.0%、64.3%±1.8%、46.2%±1.4%,C、D组显著高于A、B组(P<0.05),但D组显著低于C组(P<0.05)。各时间点A、B组SI比较差异均无统计学意义(P>0.05),C组显著低于A、B组(P<0.05),在24 h和72 h时D组显著高于C组(P<0.05)。结论 BMSCs对缺氧再给氧诱导的新生猪胰岛活性和功能损伤具有保护作用。

恒河猴肝脏cDNA文库表达序列标签测序及序列分析

恒河猴是重要的实验动物模型,其遗传学研究对于科学分析、应用动物实验结果有重要意义。我们从恒河猴肝脏cDNA文库随机挑选401个克隆单向测序,获得393条有效序列,拼接和聚类后得到221个非冗余EST序列。Swiss-prot数据库比对发现有188个Unigenes序列与已知蛋白质匹配,并与人有高度同源性,其中16个为已知恒河猴蛋白质。BLASTN比对显示,另外的33个Unigenes序列中,有26个Unigenes序列与已知恒河猴基因匹配。dbEST数据库比对表明有3个Unigenes序列为新发现的恒河猴EST序列。