铜离子螯合亲和层析纯化人铜锌超氧化物歧化酶

用铜离子螯合亲和层析对人红细胞铜锌超氧化物歧化酶进行了纯化．３次实验的结果表明，此项层析具有重复使用率高和蛋白结合量大的显著优点．提纯的人铜锌超氧化物歧化酶的比活性为３０３７Ｕ每毫克蛋白，并经活性染色和ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其纯度均一．纯化中，探索了用紫外２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的Ａ比值判断酶纯度的简便方法．

药物的聚乙二醇修饰研究进展

目的 介绍了药物聚乙二醇技术及其在药物研究中的应用最新进展。方法 以国外大量有代表性的文献为基础 ,简要论述了聚乙二醇的生理化学特性、药物的聚乙二醇修饰的优势、修饰技术及其在药物研究中的应用和存在的问题 ,并评述其应用前景。结果 药物的聚乙二醇修饰技术改变了药物的分子结构 ,从而改进了药物动力学和药效学的性质 ,增加了注射药物的临床应用范围和疗效。结论 聚乙二醇修饰技术成功应用于蛋白质药物、有机小分子的前体药物和脂质体药物的研究 。

人基质金属蛋白酶2催化区的克隆与表达

为从随机肽库中寻找具有基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )抑制活性的新型小肽抑制剂 ,应用PCR法从含有人MMP 2基因的质粒中扩增了人MMP 2的催化区 .序列分析结果表明无氨基酸突变 .然后构建人MMP 2催化区的表达载体pET MCD ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,经IPTG诱导表达人MMP 2催化区 .经包涵体分离、变性、金属螯合层析纯化和复性等过程 ,复性后的人MMP 2催化区具有较好的明胶水解活性 .

重组人肝细胞生成素的纯化及活性研究

人肝细胞生成素 ( human hepatopoietin,h HPO)是一种新型肝再生调控因子 .在大肠杆菌中表达的的重组 h HPO( rh HPO)是以包涵体的形式存在的 ,其表达量为菌体总蛋白的 2 0 % .包涵体经各种溶液洗涤后 ,用 8mol/L尿素裂解 ,裂解上清经凝胶过滤、复性和离子交换柱层析得到电泳纯的 rh HPO,经还原型 SDS- PAGE测定其分子量为 1 5k D.纯化 rh HPO的 N端氨基酸序列与其c DNA推导序列完全一致 ;纯化产物的氨基酸组成分析结果亦与 rh HPO氨基酸组成的理论值吻合 .生物学活性研究表明 ,rh

基质金属蛋白酶2抑制剂的筛选及鉴定

以原核表达的具有明胶水解活性的人基质金属蛋白酶 2的催化区 (MCD)为靶标 ,筛选噬菌体随机环七肽库和十二肽库 .找到 6种与MCD特异结合的小肽 ,将 6种小肽基因分别与GST表达质粒重组 ,进行GST融合表达 ,制备融合蛋白 .采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法纯化融合蛋白 ,通过酶抑制实验、体外侵袭实验检测融合蛋白的活性 .结果表明 ,GST C71能够抑制MCD水解 β酪蛋白的活性 ,并且对人纤维肉瘤细胞HT10

肿瘤坏死因子诱导B16细胞凋亡的核蛋白质组分析(英文)

为深入了解细胞凋亡的机制,研究了细胞凋亡过程中细胞核蛋白的变化.通过分离肿瘤坏死因子TNFα诱导的小鼠黑色素瘤B16细胞的细胞核并进行二维电泳分析,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.图像分析比较对照细胞和凋亡细胞的核蛋白发现,在凋亡细胞中有11个蛋白发生了明显的变化,6个蛋白下调,5个蛋白上调,对这11个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析.经数据库查询,初步鉴定出这些蛋白.其中4个含量增加的蛋白(HSP84,calreticulin,vimentin,GAPDH)均直接或间接地参与诱导细胞凋亡,另外1个含量增加的蛋白(plasminogen)尚未见其与细胞凋亡有关的报道.而6个含量降低的蛋白分别属于信号转导相关蛋白(guaninenucleotidebindingprotein,lamininreceptor1)、转录调控蛋白、mRNA转运蛋白(heterochromatinprotein1alpha,heterogeneousnuclearribonucleoproteinA3,heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2B1)和未知功能蛋白(nucleolarproteinNO38).细胞凋亡过程中这些变化的核蛋白质的发现将有助于深入认识细胞凋亡的分子机制.

抗人肝再生增强因子单克隆抗体的研制

目的利用纯化的重组人肝再生 增强因子(hALR)制备抗hALR的单克隆抗体,建立hALR的检测方法。方法采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,经ELISA和免疫印迹证明其特异性。 结果获得了4株分泌抗hALR特异性抗体的杂交瘤细胞 系;无血清培养液效价为1×10^(-2),腹水效价为1×10^(-5);亚类鉴定 表明:2株单克隆抗体为IgG1,另2株为IgG2b;免疫印迹显示:抗体结合抗原的分子量 与hALR相符,为特异性抗hALR抗体。结论通过杂交瘤 技术,获得了抗hALR的单克隆抗体,为以后的工作奠定了基础。

肝细胞生成素通过自分泌循环刺激肝癌细胞系的增殖

目的:证明肝细胞生成素(Hepatopoietin,HPO)是否通过自分泌循环的方式刺激体外培养的肝癌细胞系的自主性增殖。方法:以体外培养的肝癌细胞系为模型,利用RTPCR,ELISA和Westernblot观察HPO的表达;利用HPO特异性抗体封闭HPO的作用,观察封闭HPO的作用后,细胞增殖的变化。结果:显示了肝癌细胞表达HPO并可分泌到细胞培养液中,分泌的HPO有刺激肝癌细胞增殖的作用,HPO特异性抗体可中和HPO并可部分抑制肝癌细胞的自主性生长。结论:在体外培养的肝癌细胞中存在维持其自主性生长的HPO自分泌循环。

双组分核定位信号介导Apoptin定位于肿瘤细胞核

Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,在肿瘤细胞中定位于细胞核,而在正常细胞中主要分布于细胞质。根据预测,Apoptin分子中有2段序列(NLS1和NLS2)可能是单组分核定位信号。通过基因突变和缺失构建了Apoptin各种不同的核定位信号突变体和磷酸化突变体,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作标签,观察了其在肿瘤细胞中亚细胞定位的变化。结果表明,NLS1和NLS2单独均不是有效的单组分核定位信号。Apoptin的核定位信号是由NLS1和NLS2这2段序列共同组成的双组分核定位信号,缺少任何一段序列都会严重影响Apoptin在肿瘤细胞中的核定位。其中,NLS2对于Apoptin的核定位起主要作用。Apoptin的获得型磷酸化突变体并不能转位到正常细胞的细胞核中,而其磷酸化负突变体仍定位于肿瘤细胞的细胞核。另外,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂H7也不影响Apoptin在肿瘤细胞中的核定位。很可能,Apoptin的磷酸化并不参与调控其核定位信号的功能。

抗人肝再生增强因子抗体识别部位的确定

目的 :确定抗人肝再生增强因子单克隆抗体所识别的抗原表位。方法 :采用蛋白质预测软件预测人肝再生增强因子的抗原决定簇 ,根据预测结果合成肽进行竞争ELISA验证单克隆抗体所识别部位。结果 :人肝再生增强因子的第 6～ 15 ,6 8～ 80以及 10 5～ 112位氨基酸残基是其抗原表位。结论 :采用计算机软件预测 ,并在此基础上经合成肽验证的方法是一种可靠的抗原表位确定方法。

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 。

利用siRNA抑制HER-2表达的研究

目的利用siRNA抑制人乳腺癌MCF-7细胞中HER-2基因的表达。方法针对HER-2mR-NA设计了5条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染MCF-7乳腺癌细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR分析siRNA对细胞中HER-2mRNA的降解作用;利用流式细胞术分析细胞表面HER-2蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,用免疫组化法检测瘤组织中HER-2的表达。结果siRNA3P能明显降低MCF-7细胞中HER-2mRNA的丰度;流式细胞分析表明,其中siRNA2P和3P稳定转染的MCF-7细胞表面HER-2的表达明显降低;五种表达不同siRNA的MCF-7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低,并且瘤组织中HER-2蛋白的表达也明显减少。结论靶向HER-2mRNA的siRNA能在体内外有效抑制HER-2的表达,可用于乳腺癌的基因治疗。

一种测定CuZn-SOD总量的新方法——化学发光免疫分析法

通过探索,用ABEI发光剂标记人CuZn-SOD,液相竞争结合测定样品中CuZn-SOD含量。本方法试剂稳定,结果重复性好,批内CV=2.6～6.0％,批间CV=6.9～7.9％,回收率97.7～106.1％,可测范围为1～500ng,适合测定血清及体液中微量CuZn-SOD。本化学发光免疫分析为国内外尚未报道的方法。

抗整合素β_3胞外区噬菌体抗体库的构建及筛选

用RT-PCR的方法从人胶质瘤BT-325细胞中扩增人整合素β3胞外区,并克隆到载体pET-24a中构建表达载体。表达的人整合素β3胞外区经变性、复性和纯化后免疫BALB/c小鼠,提取脾脏总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,经重叠PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7超感染,构建噬菌体单链抗体库。通过淘选从该抗体库中筛选特异性识别人整合素β3胞外区的噬菌体单链抗体。结果表明,成功构建了库容为2.6×106的抗人整合素β3胞外区的单链抗体库,初步筛选到了与人整合素β3胞外区特异性结合的单链抗体。

HPO结构与受体结合功能关系的初步研究

肝细胞生成素(HPO)是一种新型细胞因子,在肝再生过程中具有重要的调控作用,研究发现在肝源细胞表面有其特异性受体。为了研究HPO结构与其受体结合功能的关系,构建并表达了HPO及其系列缺失体,利用流式细胞术检测了HPO及其系列缺失体与受体的结合能力。结果表明,在HPO的序列中可能有多个受体结合功能区,其N端的前10位氨基酸残基和C端的第11-20位氨基酸残基对于其受体结合能力是必需的,而C端前10位氨基酸残基对HPO与受体的结合有一定的抑制作用。此外HPO结构的完整性对于其受体结合功能也是必需的。

人铜锌超氧化物歧化酶的大规模生产工艺

本文以干扰素生产中废弃的人红细胞为原料，采用乙醇－氯份沉淀→磷酸氢二钾盐析→丙酮沉淀手续和ＤＥＡＥ—５２层析步骤，进行了人铜锌超氧化物歧化酶（ＣｕＺｎ－ＳＯＤ）大规模生产工艺的实验研究。结果表明，生产的酶制剂中含量为９０．６％，比活性在２０００ＭｃＣｏｒｄ—Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ单位／ｍｇ蛋白以上，无菌、无热原质、安全性等项指标符合国家卫生部对血液制品的要求。

肝细胞生成素——一种非经典分泌蛋白

肝细胞生成素(hepatopoietin ,HPO)是一种分泌蛋白.为了研究肝细胞生成素的分泌途径,利用SignalP软件分析了HPO的氨基酸序列,但HPO序列中没有经典分泌蛋白的信号肽.Western印迹实验证明,HPO能以双体形式从细胞中分泌出来.特异性体外阻断实验表明,布雷菲尔德菌素A(brefeldinA)和莫能菌素(monensin)都不能阻断HPO的分泌,说明HPO并不通过经典的内质网 高尔基体(ER -Golgi)途径分泌;优降糖(glyburide)对HPO的分泌没有抑制作用,说明HPO的分泌并不是由ABC1(ATP bindingcassette)转运子介导的;DNP和NH4Cl也不能刺激HPO的分泌,说明内体 溶酶体系统不参与HPO的分泌.上述结果表明,HPO是一种非经典分泌蛋白(non classicalsecretoryprotein) ,能以双体形式从细胞中分泌出来.但和已知的非经典分泌蛋白IL -1β不同,HPO的分泌并不是通过ABC1转运子介导的,内体 溶酶体系统也不参与其分泌.

鼠粒细胞集落刺激因子受体的纯化及鉴定

粒细胞集落刺激因子受体（ＧＣＳＦＲ）在鼠ＮＦＳ６０细胞中有较高的含量，通过对ＮＦＳ６０细胞的大规模培养，用ＣＨＡＰＳ及超速离心抽提ＧＣＳＦＲ，经ＧＣＳＦ亲和层析纯化获得ＧＣＳＦＲ，采用ＡＢＣＥＬＩＳＡ进行鉴定．

抗牛CuZn-SOD抗血清与恶性肿瘤患者血清中CuZn-SOD的抗原抗体反应

建立了化学发光免疫分析方法研究抗牛CuZn-SOD抗血清与恶性肿瘤患者血清中CuZn-SOD的抗原抗体反应。应用本法定量检测了210名健康成人,47例良性疾病和106例恶性肿瘤患者血清中免疫学性质改变的CuZn-SOD,结果表明恶性肿瘤患者血清中CuZn-SOD与抗牛CuZn-SOD抗血清之间出现显著的抗原抗体反应,从而发现恶性肿瘤患者血清中存在着免疫学性质改变的CuZn-SOD。

3′端非翻译区对重组人肝细胞生成素表达不均一性的影响

在工程菌pBV hHPO DH5α中表达的人肝细胞生成素 (hHPO)以两种分子形式存在 ,经分析可能是由于表达质粒中hHPO基因的终止密码子TAG的通读造成的。表达载体经改构后 ,去掉质粒中hHPO基因终止密码子后的非翻译区 ,采用TAA作终止密码子 。