β-内酰胺类及氟喹诺酮类抗生素对铜绿假单胞菌的防耐药突变浓度研究

目的分析β-内酰胺类抗生素美罗培南(MEM)、头孢他啶(CAZ)及氟喹诺酮类抗生素环丙沙星(CIP)和左氧氟沙星(LEV)单用对铜绿假单胞菌菌株防耐药突变浓度(MPC)的影响,考察其潜在耐药性。方法采用微量肉汤稀释法测定抗菌药物对铜绿假单胞菌标准菌株CMCC(B)10104和5株临床分离铜绿假单胞菌菌株的最低抑菌浓度(MIC),并用琼脂平板法测定其相应的最小杀菌浓度(MBC)值。采用琼脂平板稀释法测定MEM、CAZ、CIP、LEV单用对标准菌株CMCC(B)10104和5株临床分离铜绿假单胞菌菌株的MPC,并计算相应的选择指数(SI),以评估4种抗菌药物单药治疗对铜绿假单胞菌的潜在耐药性。结果根据实验数据得出铜绿假单胞菌临床分离株对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率高达80%,但其两者防耐药突变能力是相对较强的;对MEM和CAZ的耐药率分别为20%和0,防耐药突变能力是相对较弱的,4种抗生素的MPC50各为12.69μg/ml、11.31μg/ml、3.29μg/ml、8.19μg/ml;MPC_(90)各为71.58μg/ml、45.87μg/ml、30.15μg/ml、157.04μg/ml;SI范围各为3.18~25.64μg/ml、3.20~25.42μg/ml、1.59~3.20μg/ml、1.60μg/ml。结论4种抗生素长期的单药治疗对铜绿假单胞菌的潜在耐药率较高,不宜单独使用,提示临床应加强监测该4种抗生素对铜绿假单胞菌的敏感性及疗效。

甲基化酶DNMT3B基因敲除的CHO-K1细胞系构建

构建敲除DNMT3B基因的细胞系,为重组蛋白药物生产使用的高效表达系统提供DNMT3B基因缺失的稳定细胞株.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建敲除DNMT3B基因的质粒,并利用脂质体转染CHO-K1细胞进行基因编辑、T7E1核酸内酶切及筛选DNMT3B基因敲除细胞,以及软琼脂法获得单克隆.结果表明,通过对获得的单细胞克隆进行测序比对,确定DNMT3B基因第4个外显子处被编辑产生移码突变.最终获得DNMT3B基因特异位点删除的CHO细胞单克隆.

邻苯二甲酸酯类半抗原的设计合成与抗原制备

4-硝基邻苯二甲酸分别与正丁醇和2-乙基己醇发生酯化反应,再经Fe粉还原,制备两种邻苯二甲酸酯类（PAEs）半抗原——4-氨基邻苯二甲酸二丁酯（Ⅱa）和4-氨基邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（Ⅱb）,再将半抗原Ⅱb与戊二酸酐进行酰胺化反应,制备出第3种PAEs半抗原4-戊二酸单酰胺邻苯二甲酸（2-乙基己）酯（Ⅱc）,产品结构经熔点、1HNMR和MS表征。将半抗原Ⅱa-c分别与牛血清载体蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联,制备得到6种PAEs人工抗原Ⅲa-c和Ⅳa-c,并用紫外吸收光谱进行分析表征。

多环芳烃菲和荧蒽半抗原的制备及量化计算

以多环芳烃菲和荧蒽为原料,分别与丁二酸酐发生傅克酰基化反应,制备γ-羰基-2-菲丁酸和γ-羰基-3-荧蒽丁酸,再经黄鸣龙还原制备半抗原2-菲丁酸和3-荧蒽丁酸,产品结构经熔点、IR和1HNMR表征。采用量子化学计算优化两种半抗原的分子构型,获得前线轨道、能量、电子分布及稳定性等信息,辅助半抗原的设计和筛选,为制备高特异性人工抗原奠定了基础。

染色质调节元件与不同启动子的相互作用对基因表达调控的影响

为探究DNA序列元件对不同启动子调节转基因稳定表达的影响,利用遍在染色质开放元件(Ubiquitous chromatin opening elements,UCOE)和基质黏附序列(Scaffold/matrix-attachment regions,MAR)分别与含增强子的oct4基因启动子、含CpG岛的sox2基因启动子和不含调控元件的nanog基因启动子以及同时包含增强子和CpG岛的CMV启动子组合构建pOCT4-MAR、pOCT4-UCOE、pSOX2-MAR、pSOX2-UCOE、pNANOG-MAR、pNANOG-UCOE、pCMV-UCOE、pCMV-MAR等质粒,分析这些质粒稳定转染后的表达量和嵌合表达差异。结果发现,UCOE与含增强子元件的oct4启动子组合能较稳定高效表达,而MAR与含CpG岛的sox2启动子组合能较稳定高效表达。利用排除位置效应原因的嵌合表达对染色质高级结构调控基因表达的稳定性分析表明:(1)通常情况下UCOE比MAR调节的表达载体的表达更高效和更稳定;UCOE连接含CpG岛的启动子形成开放染色质调节的高表达更稳定;(2)MAR与启动子上TATA盒或增强子可能通过染色质环产生高表达,但相对不稳定。结论:染色质调节元件UCOE和MAR与启动子调控元件之间能通过染色质开放状态或染色质环调控基因稳定表达。