大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞的分离和培养

目的:体外培养大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞(NSCs),观察其生长及诱导分化培养特点。方法:取孕12.5~14.5 d的SD大鼠,采用机械分离法获取中脑腹侧组织,剪碎并吹打成单细胞悬液后,以2×10~5个细胞/ml的密度接种到无血清NSCs培养基中以神经球法培养。培养神经球5~7 d后,按原密度进行传代培养,并取第三代培养的神经球用含10%胎牛血清(FBS)分化培养液分化培养,分化培养7 d后行免疫细胞化学鉴定。结果:神经球呈巢蛋白(nestin)阳性,诱导分化后的细胞作分别呈微管蛋白(βIII-Tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。结论:经神经球法培养得到的大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞可自我增值,并可诱导分化成神经元和胶质细胞。

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。

神经干细胞和多巴胺神经元联合移植对帕金森病大鼠运动障碍的影响

目的探讨神经干细胞和多巴胺神经元联合移植改善帕金森病大鼠运动障碍的效果。方法采用经典6-羟基多巴胺毁损法构建帕金森病大鼠模型36只,腹腔注射阿朴吗啡连续诱导4周。APO注射第4周将36只帕金森病大鼠随机分为对照组、多巴胺组、干细胞组及联合组,每组9只,分别于右侧纹状体区立体定向注入生理盐水、多巴胺神经元悬液、神经干细胞悬液、多巴胺神经元与神经干细胞悬液。计算各组移植后2、4、6、8周的旋转次数;干细胞组及联合组分别于移植后1、2、4、8周行MRI扫描,观察移植区影像学变化;移植后8周取各组脑组织行普鲁士蓝染色,观察移植细胞定植与迁移情况,免疫荧光法检测移植细胞分化情况。结果移植后2、4、6、8周,对照组、神经干细胞组、多巴胺组、联合组旋转次数依次降低,组间两两比较P均<0.01。MRI检查结果:随着时间延长,联合组与干细胞组移植区T2 W/FFE成像上呈低信号影的区域逐渐变大,但联合组低信号影范围大于干细胞组。普鲁士蓝染色结果:干细胞组和联合组移植的神经干细胞及其分化后的细胞胞质内均可见大量蓝色颗粒,大部分存留在移植针孔附近,仅少部分细胞向远处迁移,但联合组蓝色颗粒数量以及扩散范围均大于干细胞组。联合组巢蛋白(Nestin)、酪氨酸羟化酶(TH)、绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干细胞组,酸性纤维蛋白(GFAP)阳性细胞数及GFAP/GFP均低于干细胞组(P均<0.01)。结论神经干细胞与多巴胺神经元联合移植可显著改善帕金森病大鼠的运动障碍,更有助于神经干细胞的定植、迁移及分化成为多巴胺神经元。

核受体相关蛋白1基因慢病毒载体的构建

目的构建使用绿色荧光蛋白(GFP)标记的核受体相关蛋白1 (nuclear receptor related 1 protein,Nurr1)慢病毒表达载体(DCE-Nurr1)并鉴定。方法使用引物设计软件Primier5设计基因Nurr1引物并采用聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增,利用XbaI和Not I分别将基因Nurr1和载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切,利用T4链接酶将已酶切的基因Nurr1和已酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接起来,完成慢病毒表达载体的构建。结果通过PCR成功地扩增了Nurr1基因并连接到载体pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP上,序列与GenBank登记的序列一致。结论成功构建DCE-Nurr1慢病毒表达载体,为进一步在体内或体外研究Nurr1基因功能及其对多巴胺神经元的保护作用提供了基础。

萃取—火焰原子吸收光谱法测定水中的铬

本文研究了以DPC/MIBK为萃取体系,用火焰原子吸收分光光度法测定水中微量铬的方法.其灵敏度(ng·ml^(-1)/1%)为1.42.根据溶液酸度、萃取剂用量、萃取时间、相比等对吸光度的影响,选择确定较佳的萃取条件.其回收率在95～109%之间,相对标准偏差为4.65%(n=10).

α-碱性氧化铁的制备及其对铬(Ⅵ)吸附性能的研究

本文对α-碱性氧化铁的制备及其对铬(Ⅵ)的吸附性能作了研究。确定了制备α-碱性氧化铁的适宜条件。结果表明,在确定的条件下所制得的α-碱性氧化铁对铬(Ⅵ)有良好的吸附性。其饱和吸附量为17mg/g;最佳吸附酸度为pH 5～6;溶液中共存的一价、二价阳离子和一价阴离子对铬(Ⅵ)的吸附基本无影响,而高价阴离子则严重干扰铬(Ⅵ)的吸附,吸附铬(Ⅵ)后的α-碱性氧化铁用0.5mol/l硫酸进行洗脱再生,效果良好,再生后的α-碱性氧化铁对铬(Ⅵ)的吸附性能基本不变。所制得的α-碱性氧化铁用于电镀厂含铬(Ⅵ)废水处理,结果满意。

Nurr-1对小胶质细胞微环境的影响

目的:探讨Nurr-1基因对小胶质细胞活化状态及其微环境的影响。方法:分离培养新生SD大鼠小胶质细胞,纯化、鉴定并分别用脂多糖(LPS)刺激活化和过表达Nurr1基因。实验随机分为小胶质细胞组、Nurr1过表达组、LPS处理组、Nurr1过表达+LPS处理组。ELISA分析过表达Nurr1基因对不同状态小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1等炎症相关因子和BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的影响。结果:(1)小胶质细胞混合培养、纯化、CD11b/c免疫细胞化学鉴定为阳性,纯度在>95%;(2)Nurr1基因过表达小胶质细胞转染阳性率>90%;(3)ELISA法检测结果显示:过表达Nurr1基因的小胶质细胞显著降低了TNF-α、IL-1的分泌,并促使了BDNF、GDNF和PDNF等神经营养因子的分泌。结论:Nurr1基因可抑制小胶质细胞的活化和减少炎症相关因子的产生,同时可促进GDNF、BDNF、PDNF等与DA能神经元存活和成熟等相关的神经营养因子的分泌。

一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良

目的建立一种简易高效的新生大鼠小胶质细胞的原代培养和纯化方法,提高小胶质细胞的产量以及纯度。方法在传统Miriam Mecha的混合胶质细胞培养方法的基础上通过改良操作,混合培养小胶质细胞,并分别采用手拍法、摇床法以及温和胰酶消化法,纯化小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化细胞。荧光显微镜下标记小胶质细胞的特异性标记物Iba1、CD11b/c进行鉴定。结果 (1)分离培养第1天小胶质细胞呈不规则圆形,折光不均匀,继续培养3~5 d,小胶质细胞逐渐出现单极或多极突起,7 d时部分细胞转为静止状态,呈分枝状;(2)纯化后小胶质细胞多呈静息状态,细胞免疫荧光CD11b/c、Iba1双阳性;(3)不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示:手拍法纯化小胶质细胞,细胞阳性率(>96%)明显高于胰酶消化法(>90%,P<0.05),前者细胞产量明显高于摇床法(P<0.05)。结论通过改良传统Miriam Mecha的混合小胶质细胞的培养和纯化方法,可以提高小胶质细胞产量以及纯度。

Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究

目的探讨联合过表达核受体相关因子1(Nurr1)基因的小胶质细胞(MG)和神经干细胞(NSC)共培养对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。方法原代培养SD大鼠神经干细胞和小胶质细胞,并过表达Nurr1基因。CCK-8法检测Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率的影响。Transwell系统共培养神经干细胞和小胶质细胞,实验分为NSC组、NSC+MG组和N(NSC+MG)组。ELISA检测共培养后第3天、第6天和第9天各组脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性神经营养因子(PDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达变化;RT-PCR和Western Blot检测各组第9天酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)DAT和Nurr1的表达变化;细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化,并对TH和DAT阳性细胞计数,计算各组神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。结果原代培养小胶质细胞以及神经干细胞并成功过表达Nurr1基因。CCK-8法检测结果表明,Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率无明显影响。ELISA检测结果表明,N(NSC+MG)组在不同时间点神经营养因子(BDNF、PDNF和GDNF)表达量明显高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR和Westen Blot检测结果表明,N(NSC+MG)组TH、DAT和Nurr1的表达水平明显高于其他各组(P<0.05)。细胞免疫荧光鉴定结果表明,N(NSC+MG)组TH阳性细胞率明显高于其他各组(P<0.05)。结论Nurr1基因可促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞共培养可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化。

芹黄素抑制小胶质细胞活化作用研究

目的探讨芹黄素对小胶质细胞活化的抑制作用。方法原代培养SD大鼠小胶质细胞,实验随机分为空白对照组、脂多糖组(LPS组)、LPS+芹黄素(10μM)组、LPS+芹黄素(20μM)组、LPS+芹黄素(50μM)组。MTT法检测芹黄素对小胶质细胞活性的影响;ELISA法检测IL-1、IL-10等炎症相关因子以及BDNF、PDNF等神经营养因子的表达;RTPCR、western blot检测炎症相关基因i NOS转录以及表达水平。结果 MTT检测结果表明,芹黄素对小胶质细胞活性无明显抑制。LPS刺激后,芹黄素预处理组IL-1等炎症因子表达水平明显低于单独LPS组(P<0.05);而芹黄素预处理组IL-10的表达则高于单独LPS组(P<0.01);与此同时,BDNF、PDNF等神经营养因子的分泌也有相同趋势(P<0.05)。芹黄素预处理组i NOS表达和转录水平也低于单独LPS组(P<0.05)。结论芹黄素可抑制活化状态小胶质细胞炎症因子以及炎症相关蛋白的表达,并可同时促进与神经元分化成熟相关神经营养因子的分泌。

Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨移植Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞对帕金森大鼠的治疗效果。方法(1)建立SD大鼠帕金森病模型;(2)原代培养SD大鼠胚胎中脑神经干细胞,并于神经干细胞过表达Nurr1;(3)移植治疗分组:假手术组(A组),移植神经干细胞组(B组),移植Nurr1修饰神经干细胞组(C组);(4)在移植后3周、6周、9周和12周分别对各组大鼠进行行为学测试,观察各组症状改善情况;(5)移植12周后,分别检测各组中Nurr1、TH蛋白表达情况和Nurr1荧光情况。结果(1)原代培养大鼠胚胎中脑神经干细胞,并于神经干细胞成功过表达Nurr1基因。(2)免疫荧光、Western Blot证实过表达Nurr1可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化(P<0.05)。(3)移植Nurr1修饰神经干细胞可以有效的改善帕金森大鼠的症状(P<0.05),Western Blot证实小胶质细胞可显著促进移植后的神经干细胞在分化为多巴胺能神经元(P<0.05)。(4)移植后Nurr1能促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化,提高移植神经干细胞的存活,达到更好治疗效果。结论Nurr1基因可以促进神经干细胞向多巴胺能神经元转化;移植修饰Nurr1神经干细胞可以有效治疗帕金森大鼠。

糖化血红蛋白在妊娠期糖尿病中的应用

目的探讨糖化血红蛋白（HbAlc）在妊娠期糖尿病（GDM）诊断中的应用。方法回顾性选取2428周孕妇451例进行空腹血糖,75g葡萄糖糖耐量试验（OGTT）及糖化血红蛋白的测定,根据ADA诊断标准将其分为正常组248例,GDM组203例。采用独立样本的t检验统计学方法分析2组的空腹血糖,餐后1h血糖,餐后2h血糖及糖化血红蛋白数据的差异性。再绘制诊断ROC曲线,分析HbAlc在GDM筛查诊断中的作用。结果正常组与GDM组糖化血红蛋白水平有明显差异具有统计学意义（P〈0.05）;以HbAlc值绘制诊断ROC曲线,曲线下面积（area under curve,AUC）为0.63,95%置信区间0.5840.675,取糖化血红蛋白诊断切点为4.6%。结论 HbAlc≥4.6%不适合GDM早期诊断的标准,但HbAlc≥5.5%在GDM诊断的特异性上有一定的意义。

瑞安市26734例孕中期产前筛查分析

目的:对我院门诊26 734例孕中期产前筛查各年龄段高风险率分布情况进行分析,确定最佳怀孕年龄,降低出生缺陷发生率。方法:应用时间分辨荧光免疫法对孕15～20周孕妇血清甲胎蛋白(AFP)和游离绒毛膜促腺激素(F-βhCG)进行检测。结果:筛查高风险孕妇1 262例,阳性率为4.7%。在不同年龄段的高风险分组中,≥35岁孕妇跟<35岁孕妇两组作统计比较,风险率差异有统计学意义(P<0.01),21-三体综合征(Ds)风险率在21～25岁最低且有统计学意义(P<0.01),18-三体综合征(Es)在18～30岁风险率无明显差异(P>0.05),神经管畸形(NTDs)在各年龄段均无显著差异(P>0.05)。结论:最佳怀孕年龄在21～25岁,大于30岁孕妇Ds、Es风险率显著升高,但NTDs风险率与年龄无关。

胎膜早破待产妇下生殖道支原体和衣原体感染及支原体耐药性分析

目的了解瑞安市胎膜早破患者生殖道的支原体、衣原体的感染状况及支原体的耐药状况。方法对626例胎膜早破晚孕患者的宫颈分泌物进行支原体培养及药敏和衣原体快速检测。结果626例胎膜早破病例中,支原体培养阳性为516例,总感染率为82.4%;其中单独解脲支原体(Uu)阳性348例(55.6%),对交沙霉素、米诺环素、强力霉素、阿奇霉素、红霉素、罗红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、林可霉素耐药率分别为1.1%、6.3%、6.6%、10.6%、14.7%、17.8%、27.3%、63.1%、94.6%;Uu与人型支原体(Mh)混合感染158例(25.2%),对上述药物耐药率分别为4.4%、8.6%、9.2%、90.0%、94.8%、95.6%、42.5%、69.9%、95.1%;单独Mh感染10例(1.6%),对交沙霉素、强力霉素、米诺环素高敏感,耐药率均为0,对林可霉素耐药率为10.0%;衣原体阳性34例(5.43%)。结论胎膜早破患者中支原体的高检出率提示其与胎膜早破密切相关;支原体体外药敏试验对交沙霉素、米诺环素、强力霉素敏感率较高。

瑞安地区妇女宫颈人乳头瘤病毒感染现状的调查

宫颈癌的病死率在妇女癌症死亡率中已占第二位，现有研究已经证实宫颈高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是引起子宫颈癌及癌前病变的必要条件，大多数HPV感染者能够自愈，少数感染者迁延不愈或者反复感染最终发展为宫颈癌，因此早发现、早治疗非常重要，就目前而言HPV感染的检测是宫颈癌筛查的必要措施，分析HPV基因亚型分布的影响因素，为宫颈癌的防治提供一定实验依据。报道如下。

小胶质细胞与神经干细胞共同培养对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

目的 探讨小胶质细胞与神经干细胞（NSCs）共同培养条件下对NSCs向多巴胺能神经元分化的促进作用。方法 （1）原代培养新生SD大鼠的小胶质细胞并鉴定。原代培养孕14 d SD大鼠胚胎NSCs并鉴定。（2）取鉴定后细胞分为NSCs单独培养组和小胶质细胞与NSCs共同培养组。2组细胞培养6 d后，采用细胞免疫荧光法及Western blotting实验检测多巴胺能神经元分化与成熟相关因子酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）及炎症因子3（Pitx3）蛋白的表达，采用PCR技术检测2组细胞TH、DAT以Pitx3基因转录水平的差异。结果 （1）新生SD大鼠小胶质细胞CD11b/c染色阳性，所得到的小胶质细胞纯度〉95%。孕14 d SD大鼠NSCs巢蛋白染色阳性。（2）细胞免疫荧光染色结果显示：与单独培养组比较，共同培养组NSCs TH、DAT及Pitx3阳性蛋白明显增多。Western blotting实验结果显示：共同培养组细胞TH、DAT以及Pitx3蛋白的表达量明显高于单独培养组，差异有统计学意义（P〈0.05）。（3）PCR实验结果显示：共同培养组TH、DAT以及Pitx3基因转录水平均明显高于单独培养组，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 小胶质细胞与NSCs共同培养可促进NSCs向多巴胺能神经元分化。

瑞安市高三学生谷丙转氨酶异常影响因素分析

目的了解瑞安市高三学生高考体检谷丙转氨酶(ALT)异常的原因,为有效防控高三年级学生肝功能异常提供依据。方法选取参加2014年和2015年瑞安市高考体检的学生(男生6 734名,女生6 216名),空腹检测肘静脉血谷丙转氨酶。随机选取100名ALT≥80 U/L的学生为异常组,150名健康学生(ALT<40 U/L)为对照组,对其进行进一步检测可能相关指标,同时发放问卷调查学生相关信息。结果 ALT异常占总体检人数的1.07%(139/12 950),ALT异常组性别构成(男生占88%,女生占12%)与对照组(男生占56%,女生占44%)差异有统计学意义(χ2=28.62,P<0.01)。单因素分析显示,ALT异常组与对照组比较,BMI,SUA,AST,TG,TC,LDL、乙肝大三阳、饮食习惯、睡眠时间、近期用药史差异均有统计学意义(P值均<0.01);多因素Logistic回归分析显示,肝胆疾病史、TG、饮食习惯、LDL、BMI、SUA为ALT异常的危险因素(OR值分别为36.15,8.80,4.35,3.03,1.42,1.02)。在调整其他因素影响的条件下,低脂饮食与合理搭配饮食比较,前者患病的风险是后者的2.40和4.35倍;有肝胆疾病史与无肝胆疾病史比较,前者患病的风险是后者的36.15倍;BMI每增加1个单位,患病风险增加1.42倍。结论瑞安市高三学生高考体检谷丙转氨酶异常与多种因素有关。应加大相关知识的宣传,以降低学生ALT异常率。

D-二聚体测定对妊娠子痫前期孕产妇产后出血的预测意义

目的探讨D-二聚体检测对妊娠子痫前期孕产妇产后出血的预测意义。方法选取2012年10月-2014年9月本院产科收治的144例妊娠期子痫前期的孕产妇,对其分娩前24 h内D-二聚体进行测定,并准确计量其分娩后24 h的总出血量,依出血量将其分为产后出血组与对照组。组间比较采用Wilcoxon秩和检验,分析其分娩前24 h内D-二聚体测定值与分娩后24 h内的出血量的相关性,以ROC曲线分析其对妊娠期子痫前期孕产妇产后出血的预测截断值。结果产后出血31例,产后出血率为21.53%（31/144）。与对照组比较,产后出血组D-二聚体的含量为（3 200.39±2 209.68）mg/ml,显著高于对照组D-二聚体的含量,即（1 658.58±790.32）mg/ml,差异有统计学意义（z=4.87,P〈0.01）。ROC曲线下方面积为0.786 2,95%CI为0.698 6～0.873 8,对应的最佳切割点为D-二聚体取值为2 007.76 mg/ml时,灵敏度为70.97%,特异度为70.80%,Youden指数为41.77%,正确率为70.83%。结论 D-二聚体检测对妊娠子痫前期孕妇产后出血的预测有意义,以2 007.76 mg/ml作为产后出血的预测截断值较理想。

高考生肝功能异常与其他生化指标的关系

目的探讨高考生肝功能异常与其他各生化指标间的关系。方法对参加2014年和2015年瑞安市高考体检的学生空腹检测肘静脉血ALT,并进一步检测AST、SUA、TC、TG、LDL、HDL、FPG。结果 ALT异常占总体检人数的1.07%(139/12 950),ALT异常组男女比率为7.33∶1(88/12),高于对照组1.27∶1(84/66),差异有统计学意义(P<0.01);单变量分析显示,ALT异常组BMI、SUA、AST、TG、TC、LDL水平与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),2组间FPG、HDL水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。多因素Logistic回归分析显示,TG、LDL、BMI、SUA为ALT异常的危险因素,OR值分别为8.804 0、3.029 9、1.415 2、1.015 0。多元线性回归分析显示,ALT水平与SUA、TG、LDL、TC水平呈正相关,相较于LDL与TC、UA和TG的关联性更高。结论高考生SUA、TC、TG、LDL升高与ALT呈正相关。