牛环形泰勒虫AMA1基因表达载体的构建及生物信息学分析

为构建牛环形泰勒虫AMA1(TaAMA1)截短基因原核、真核表达载体,对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以牛环形泰勒虫阳性DNA为模板,在牛环形泰勒虫AMA1基因的开放性阅读框内设计特异性引物,采用PCR扩增AMA1基因,构建其原核表达质粒pET28a-AMA1及真核表达质粒pEGFP-AMA1。通过生物信息学在线软件分析TaAMA1基因的系统进化树及该蛋白的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位及二级结构,构建该重组蛋白系统发育进化树。结果显示,TaAMA1基因PCR扩增产物大小为828 bp,与预期片段一致,构建的重组质粒经双酶切鉴定表明目的基因插入正确,测序结果与GenBank已收录的牛环形泰勒虫AMA1基因序列(KX231677.1)同源性为99.72%,同源性及系统进化树分析发现与小泰勒虫氨基酸序列同源性最大为69.9%,生物信息学分析发现TaAMA1基因编码蛋白含276个氨基酸,分子式为C_(1331)H_(2134)N_(398)O_(413)S_(4),分子质量为30.448 ku,理论等电点为9.94,有38个磷酸化修饰位点,无跨膜区及信号肽,亚细胞定位预测位于细胞核的比例为87%;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有9个潜在抗原表位;TaAMA1蛋白的二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲和延伸链分别占23.91%、7.61%、49.64%和18.84%。成功构建重组原核表达质粒pET28a-AMA1及真核表达质粒pEGFP-AMA1并进行生物信息学分析,为牛环形泰勒虫AMA1蛋白生物学功能及入侵机制研究奠定了基础。

环形泰勒虫TAMS1蛋白的生物学特性分析及多克隆抗体的制备

为了解环形泰勒虫(Ta)TAMS1蛋白(Ta-TAMS1)的生物学特性及其是否具有抗原性,本研究利用PCR技术扩增环形泰勒虫Tams1基因,得到768 bp的Tams1基因目的片段,并将其翻译成相应的蛋白,经各种生物信息学软件分析显示,Ta-TAMS1蛋白理论等电点为8.32,有30个磷酸化位点;二级结构主要由延伸链(33.59%)组成,无规则卷曲占29.69%;具有8个B细胞抗原表位,其疏水平均值为-0.75,为疏水性蛋白。构建原核表达质粒p ET-28a-Tams1并转至大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导获得大小约32 ku的重组融合蛋白Ta-TAMS1;western blot鉴定结果显示,该重组蛋白与环形泰勒虫阳性血清呈阳性反应,反应性较好。将纯化的融合蛋白免疫兔,制备兔多克隆抗体,经间接ELISA方法检测多抗的效价。结果显示获得了Ta-TASM1蛋白多克隆抗体,ELISA检测其效价为1.204800。该研究为探究Ta-TAMS1蛋白的生物学功能及病原体的血清学快速检测方法奠定基础。

新疆部分地区牛梨形虫和无浆体感染情况调查分析

为了解新疆吐鲁番与阿勒泰地区牛梨形虫及牛无浆体的感染率和种类,采用聚合酶链反应(PCR)技术对两地区随机采集的120份牛血样品进行了泰勒虫、巴贝斯虫及无浆体的病原检测,对感染率进行统计学分析,并对其系统发育进行分析。结果显示,牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫及牛无浆体感染率分别为20.8%(25/120)、14.2%(17/120)和11.7%(14/120),其中28头牛感染2种~3种病原,呈混合感染。调查结果可为上述两地区泰勒虫病、巴贝斯虫病及无浆体虫病防控提供参考。

边缘革蜱铁蛋白1的原核表达与理化特性分析

为探明蜱源铁蛋白1(FER1)在边缘革蜱铁代谢中的功能,本研究经PCR扩增了边缘革蜱源FER1基因编码区(CDs),测序结果显示FER1基因CDs区为519 bp;BLAST分析其与硬蜱科常见蜱FER1的氨基酸序列同源性,利用Mega 6.0软件分析了FER1基因与其他常见蜱该基因之间的系统进化关系;利用Swiss-model、Vaxijen2.0及Allertop等程序预测分析了FER1的空间结构、抗原性等特性。结果显示,FER1基因与革蜱属其他种之间进化关系较近,其编码的氨基酸序列与硬蜱科常见蜱FER1氨基酸序列之间差异很小,边缘革蜱FER1基因的CDs区编码172个氨基酸,理论等电点(pI)为5.04,该蛋白以中空的24聚体形式存在,单个亚基的抗原位点主要集中在aa8~aa12、aa80~aa93处,位于24聚体模型表面,具有抗原性。氨基酸线性片段预测FER1未显示过敏性。将FER1基因克隆至原核表达载体,构建重组质粒pET-28a-FER1,表达重组FER1蛋白(rFER1),western blot检测其免疫原性,结果显示该蛋白具有良好的反应原性,并经His-Bind镍柱亲和层析获得纯化蛋白,其大小为25 ku。本研究分析了FER1蛋白的氨基酸序列同源及FER1基因的系统进化关系,预测了该蛋白的空间结构、抗原性等特性,通过重组蛋白表达与血清学试验,推断FER1可能存在于蜱唾液腺中,说明该蛋白具有作为抗蜱疫苗候选抗原的潜力。

拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱超微形态

【目的】本研究旨在阐明新疆地区优势种拉合尔钝缘蜱Ornithodoros lahorensis不同龄期若蜱超微形态及其发育特征,为软蜱的形态特征研究及龄期划分提供形态学依据。【方法】在实验室条件下培养获得拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱虫体,分别通过体视显微镜与扫描电子显微镜对拉合尔钝缘蜱不同龄期若蜱形态特征进行详细观察。【结果】在体视显微镜下,1-5龄若蜱虫体均呈椭圆形,前端稍尖后端钝圆,体表呈淡黄色或黄褐色,有4对足。在扫描电子显微镜下,1-5龄若蜱具有如下相同特征:表皮均呈褶皱样;有瘤突;哈氏器呈横裂样;口下板呈矛形;气门呈半圆形;肛门呈圆形,由叶状肛瓣构成,无肛后横沟。1-5龄若蜱间的不同特征为:1龄若蜱刚毛长且粗,无瘤突,口下板顶端凹陷且齿式为2|2,无气门板;2龄若蜱瘤突不明显,口下板顶端有小凹陷且齿式为3|3,有气门板;3龄若蜱瘤突明显;4龄若蜱肛瓣毛为6对;5龄若蜱肛瓣毛为7对。【结论】拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱在体视显微镜下观察的形态结构基本相似;在扫描电子显微镜下观察的刚毛、瘤突、口下板、齿式、气门、气门板、肛瓣毛、肛前沟和肛中沟等形态特征可作为拉合尔钝缘蜱1-5龄若蜱的鉴定特征。本研究首次详细描述了拉合尔钝缘蜱各龄期若蜱形态结构,为软蜱龄期划分及生活史研究提供依据。

铁蛋白1基因在边缘革蜱各发育龄期、吸血期及不同器官中的表达分析

试验旨在了解铁蛋白1(ferritin 1,Fer1)基因在边缘革蜱各发育龄期、吸血期及不同器官中的表达情况。用实时定量荧光PCR法分析了Fer1基因在边缘革蜱各发育阶段、吸血期和不同器官中的相对表达情况,以饥饿雌蜱为基准(1 FC),用2-△△Ct法计算结果。结果显示,雌性蜱在开始吸血后第72 h Fer1基因的相对表达量最高,在刚刚孵化的饥饿成蜱(雌、雄)、卵及幼蜱中相对表达量较低;在若蜱中相对表达量较高,其中,幼蜱和若蜱在饥饿状态下比同时期饱血蜱的相对表达量高。在雌蜱的不同器官中,以饱血蜱唾液腺为基准(1 FC),半饱血蜱中肠的表达量最高,在卵巢和马氏管不表达;在饱血蜱唾液腺、中肠、卵巢和马氏管中均表达,其中,在卵巢和马氏管中的表达量较高,中肠次之,唾液腺中的表达较低。试验结果表明,边缘革蜱体内Fer1基因的相对表达量随着蜱吸血过程变化而变化,这与蜱体内消化细胞的完善及消化酶在该过程中的变化相关,可为该类蜱铁代谢通路中关键功能基因的研究提供参考。

新疆部分地区牛蜱传无浆体和环形泰勒虫调查

为了调查新疆部分地区牛蜱传无浆体和环形泰勒虫情况,本试验采集吐鲁番、阿勒泰和伊犁州共3个地区356份牛全血样品,用PCR方法检测无浆体和环形泰勒虫,用SPSS软件进行数据统计分析,用MAGE 7.0软件进行相应病原靶基因的系统进化分析。PCR结果显示,新疆3个地区蜱传绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫感染率分别为21.9%(78/356)、37.4%(133/356)、41.6%(148/356);SPSS分析结果显示,3个地区3种病原单一感染率不存在显著性差异(P>0.05);测序分析显示,绵羊无浆体、牛无浆体的16S rRNA和环形泰勒虫的Tams 1基因与GenBank中登录的其他地区分离株的同源性分别是98%~100%、96%~99%和95%~98%;遗传进化分析显示,伊犁州和阿勒泰地区的绵羊无浆体遗传距离较近,与吐鲁番地区较远;阿勒泰和吐鲁番地区的牛无浆体、环形泰勒虫的遗传距离较近,与伊犁州地区较远。本试验所获得的新疆部分地区牛蜱传病原感染及分布情况的数据为其有效防控打下坚实的基础。

新疆吐鲁番及阿勒泰主要奶牛产区环形泰勒虫PCR检测及Tams1基因分析

为了解环形泰勒虫在新疆吐鲁番及阿勒泰主要奶牛产区中的流行情况。本试验选择位于吐鲁番地区的托克逊县和位于阿勒泰地区的富蕴县为试验点,共采集80份牛全血样品,以不同地区、不同性别、不同年龄段、不同品种分组后,采用PCR方法进行环形泰勒虫检测,并对托克逊县和富蕴县2个地区的部分环形泰勒虫阳性样品进行了测序和系统进化分析。结果显示,托克逊县和富蕴县2个地区环形泰勒虫感染率为31.25%(25/80),托克逊县感染率为40.00%(12/30),富蕴县感染率为26.00%(13/50)。系统进化树结果表明,环形泰勒虫托克逊县地方株和富蕴县地方株与河南株亲缘关系较近,与印度、西班牙等其他地区的地方株亲缘关系较远。本次试验结果为新疆吐鲁番及阿勒泰主要奶牛产区环形泰勒虫病的防治提供了基础数据。

环形泰勒虫与牛无浆体双重PCR方法的建立

旨在建立快速检测环形泰勒虫和牛无浆体的双重PCR方法,调查吐鲁番地区这2种病原感染情况。根据NCBI库中上传的环形泰勒虫Spm2、Tams1基因和牛无浆体16S rRNA基因保守序列设计、合成3对特异性引物,使用PCR扩增并测序。根据Spm2和16S rRNA基因设计双重PCR并对反应体系及条件进行优化,对该方法进行特异性、灵敏性和重复性检测,建立一种双重PCR方法。结果显示,双重PCR方法特异性扩增出环形泰勒虫和牛无浆体相应目的片段,片段大小分别为853,351 bp,而驽巴贝斯虫、马泰勒虫、绵羊无浆体和伊氏锥虫均未扩增出条带。对环形泰勒虫Spm2、Tams1和牛无浆体16S rRNA基因序列进行系统发育分析,环形泰勒虫Spm2基因序列与印度株同源关系最近(MH844677)、Tams1基因序列与突尼斯株同源关系近(AF214899),牛无浆体16S rRNA基因序列与突尼斯株同源关系近(KY655808)。此方法能检测环形泰勒虫与牛无浆体最低浓度分别为2.9×10^(-16),1.8×10^(-19)g/μL。用该方法对临床60份牛血DNA进行双重PCR扩增,其中环形泰勒虫阳性率为66.7%(40/60),牛无浆体阳性率为53.3%(32/60),混合感染阳性率为43.3%(26/60)。双重PCR方法与已建立的环形泰勒虫和牛无浆体单一PCR方法检测结果的符合率为93.3%。成功建立了一种能同时检测2种病原的双重PCR方法。

新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性分析

为了对新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性进行分析,本研究对新疆托克逊、艾丁湖、青河和伊吾地区奶牛血液DNA进行检测,采用PCR方法对Tams1基因扩增、克隆和测序,并进行序列比对。通过MEGA、DNAsp、NetNGlyc等软件及在线软件分析Tams1基因及其蛋白序列。结果显示:(1)新疆地区23条环形泰勒虫序列除伊吾地区2号样品序列被归为G3型,其余均属于G1型;此外,新疆地区Tams1基因序列在核苷酸与氨基酸水平上分别具有90.1%~100%和83.9%~100%的相似性。(2)Tams1序列在核苷酸的168~217和479~528位置之间可检测到广泛序列变异。通过Hd=0.994±0.006、π=0.071±0.002、S=178、h=38及k=52.32均显示Tams1序列较高的遗传多样性;中性指数结果显示当地环形泰勒虫Tams1基因单倍型数大于多态位点个数,遗传多样性呈平衡选择。(3)Tams1蛋白的N末端显示出较大的序列变异性,在3个区域(氨基酸位置27~52、138~175和180~196)存在广泛变异。经B细胞抗原表位预测及3D结构同源建模,发现Tams1蛋白抗原位点多位于表面,其抗原性较好。综上,本研究发现本次备选采样点的环形泰勒虫具有较高的遗传多样性,该数据可为后续环形泰勒虫基因型和种群结构变化、不同致病特性及逃避宿主免疫机制等研究提供参考。

牛无浆体PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、特异、敏感的牛无浆体(Anaplasma bovis)PCR检测方法及了解新疆部分地区牛无浆体感染情况,根据牛无浆体16S rRNA基因序列(MH255941.1)设计1对引物,建立了检测牛无浆体PCR方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验、临床样品检测及系统进化分析。结果显示,所建立的方法能特异性地鉴别牛无浆体,与环形泰勒虫(Theileria annulata)、绵羊无浆体(A.ovis)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)基因组均无交叉反应,该方法检测下限可达到1.02×10^(-18)g/μL,比文献报道的PCR敏感10倍(8.9×10^(-18)g/μL);具有良好的重复性;对94份牛临床血液样品检测结果表明,牛无浆体的阳性率为54.3%(51/94),高于文献报道的PCR方法的检测结果37.2%(35/94);系统进化树显示,三个地区的牛无浆体菌株都不在同一分支上。结论,成功构建了牛无浆体PCR快速检测方法,这为牛无浆体的快速诊断及流行病学调查奠定基础。