PKA含量动力学检测方法的研究与建立

目的建立激肽释放酶原激活剂(prekallikrein activator, PKA)含量的动力学检测方法,并对该方法进行验证。方法对比不同样品稀释缓冲液的pH、离子强度,各步骤的孵育时间、孵育温度等因素,确定检测方法的最适条件。并对该方法的准确度、专属性、精密度、线性、稳定性和耐用性进行方法学验证。结果确定以0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5、含0.15 mol/L NaCl)稀释样品,在37℃下与激肽释放酶原(PK)试剂混合孵育20 min后加入底物S-2302,检测反应前10 min内吸光度变化率△A405/min。方法验证结果表明PKA含量在(0.5~4.0)IU/mL范围内,△A405/min与含量呈良好的线性关系,标准曲线相关系数R2>0.99,校正标样回收率在96.9%~103.7%。专属性验证表明人血白蛋白和静注人免疫球蛋白(pH4)的辅料、低pH及蛋白质含量等因素对该方法检测PKA含量均无明显影响,各溶液的加标回收率分别为98.0%(0.9%NaCl溶液)、95.3%(0.46%辛酸钠溶液)、96.7%(10%麦芽糖溶液,pH4.0)、94.0%(20%BSA)、94.0%(5%BSA,pH4.0)。在(0.5~4.0)IU/mL内,该方法准确度和精密度均符合要求。其中质控品批内回收率在96.4%~109.5%, CV在0.2%~6.9%,批间回收率在101.5%~102.9%, CV在2.6%~5.9%。PK试剂和S-2302在室温放置6 h内,线性、准确度和精密度均能符合要求,质控品回收率在94.9%~109.9%。采用新建的动力学法和《中国药典》(ChP)2015年版终点法检测本公司生产的20批次人血白蛋白样品中PKA含量的结果对比表明2种分析方法差异无统计学意义(P>0.05),2种方法的相关系数为0.99805(n=20)。结论建立的PKA含量动力学检测方法,具有良好的线性、专属性、准确度、精密度、稳定性、耐用性,相比《中国药典》方法,新建方法更节省分析时间,更为方便、准确、快速,可实现快速测定人血白蛋白和静注人免疫球蛋白(pH4)PKA含量测定。

高效液相色谱法检测人凝血因子Ⅷ中氨丁三醇残留量

目的 建立氨丁三醇的高效液相色谱检测方法,并对该方法进行验证。方法 以丙氨酸为内标,使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)进行柱前衍生,Inertsil~? ODS-SP为色谱柱,以乙酸-乙酸钠缓冲液和乙腈进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温37℃,进样体积25μL,使用紫外检测器,以248 nm进行检测。同时对该方法进行验证。结果 辅料甘氨酸、枸橼酸钠和氯化钙对氨丁三醇残留量的检测均无干扰;加标回收率为90.0%~100.8%;重复性验证的相对标准偏差(RSD)分别为2.5%、0.7%和1.2%,中间精密度RSD为0.8%。氨丁三醇对照品在(0.5~4.0)μg/mL范围浓度和与内标峰面积比值呈良好的线性关系,回归方程为Y=0.012 9X-0.000 782,R=0.999 97;定量限为0.04μg/mL。结论 成功的建立了人凝血因子Ⅷ中氨丁三醇残留量的高效液相色谱检测方法,该方法具有良好的线性、专属性、准确度、精密度。

第二批人血白蛋白国家对照品的研制标定

目的研制第二批人血白蛋白国家对照品,用于人血白蛋白等相关产品的质量活动。方法选择批签发检验合格的人血白蛋白产品作为原料进行合并、除菌、分装。制备后按照2020年版《中国药典》三部人血白蛋白各论要求,选择蛋白质含量、辛酸钠含量、乙酰色氨酸含量、多聚体含量、钠离子含量、pH、吸光度共7个检验项目进行多实验室协作标定。除乙酰色氨酸由5家实验室协作标定外,其余项目均由11家实验室完成协作标定。在LAB01开展对照品的稳定性监测。结果依据各实验室协作标定结果,该批国家对照品确立的参考范围分别为:蛋白质含量均值204.03 g·L^(-1),95%可信区间(203.05,205.00)g·L^(-1),参考范围(204.03±2.90)g·L^(-1);辛酸钠含量均值16.21 mmol·L^(-1),95%可信区间(15.98,16.44)mmol·L^(-1),参考范围(16.21±0.70)mmol·L^(-1);乙酰色氨酸含量均值16.28 mmol·L^(-1),95%可信区间(15.82,16.74)mmol·L^(-1),参考范围(16.28±0.74)mmol·L^(-1);多聚体峰面积百分比均值7.43%,95%可信区间(7.30,7.56)%,参考范围(7.43±0.38)%(HPLC-SEC);pH值均值6.95,95%可信区间(6.92,6.98),参考范围(6.95±0.08)[测定温度(22±5)℃];吸光度均值0.06,95%可信区间(0.06,0.06),参考范围(0.06±0.01);钠离子含量均值135.2 mmol·L^(-1),95%可信区间(131.2,139.2)mmol·L^(-1),参考范围(135±12)mmol·L^(-1)。所有检测项目结果在考察期内量值没有发生趋势性变化。结论该批人血白蛋白国家对照品符合相关要求,可以发放使用。

首批HPLC-SEC系统适用性免疫球蛋白国家对照品研制

目的研制一种高效液相分子排阻色谱(HPLC-SEC)系统适用性免疫球蛋白国家对照品,用于免疫球蛋白类产品等分子大小分布系统适用性确认。方法制备符合技术指标要求的静注人免疫球蛋白产品作为对照品原料,合并后进行除菌过滤,最后分装。按照《中国药典》2020年版三部附录中“人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定方法”,在8家实验室进行协作标定,同时进行稳定性监测。结果8家实验室测定本批对照品单体与裂解物分离度(R)均>1.5(均值为2.3),实验条件均符合《中国药典》2020年版三部中相关要求;8家实验室对照品裂解物峰面积百分比均值为3.83%,95%置信区间(3.48,4.19)%,均>2.0%,满足预期技术要求。在2~8℃下持续对该对照品进行14个月稳定性监测,分离度(R)符合《中国药典》要求,裂解物峰面积百分比未发生趋势性变化,建议对照品按2~8℃保存和运输。结论HPLC-SEC系统适用性免疫球蛋白国家对照品可以用于《中国药典》2020年版要求的系统适用性测试,有助于提升免疫球蛋白等产品分子大小分布检测结果可靠性。

重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品的研制

目的制备重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品,用于重组人血白蛋白产品的质量控制。方法以重组人血白蛋白为原料,经灭菌注射用水稀释、除菌过滤后,进行分装、冻干,制备重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品。8家实验室采用凯氏定氮法进行协作标定,并检测标准品的分装误差、水分含量、均匀性及稳定性。结果8家实验室测定本批标准品蛋白质含量实验室间均值为19.05 mg/mL,95%置信区间为18.80~19.31 mg/mL,均值标准差为0.3087 mg/mL,标准误为0.1091 mg/mL,相对标准偏差(RSD)为1.62%。标准品分装过程前、中、后段随机抽取6支样品,分装误差为-0.07%~0.08%,均在±0.1%以内;3支标准品样品的水分含量分别为1.44%、2.43%、2.25%,均<3.0%;5支标准品样品的装量差异为-0.5%~0.5%,均在±1%以内;标准品于-20℃保存2~14个月时蛋白质含量为18.09~18.88 mg/mL,于-20、4、23、32℃保存6个月时蛋白质含量为18.35~18.82 mg/mL,两者变化均较小。结论制备的重组人血白蛋白蛋白质含量RS20国家标准品符合相关规定,规定代码为:280030-201901,可用于重组人血白蛋白产品的相关质量控制。